амплификация в онкологии что это такое
Амплификация в онкологии что это такое
HER2, амплификация гена HER2, FISH, HER2/neu, рак молочной железы, рак желудка, серозная карцинома эндометрия.
Синонимы английские
HER2, HER2 gene amplification, FISH, HER2 / neu, breast cancer, gastric cancer, endometrial serous carcinoma.
Диагностический фрагментный анализ.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.
Общая информация об исследовании
Ген HER2 кодирует трансмембранный тирозинкиназный рецептор, который принадлежит к семейству рецепторов EGF (EGFR). Это семейство включает в себя четыре вида рецепторов (EGFR/HER1, HER2, HER3 и HER4), которые функционируют за счет стимуляции сигнальных путей фактора роста, таких как путь PI3K – AKT – mTOR. Рецепторы этого семейства содержат внеклеточный лигандсвязывающий домен, липофильный трансмембранный домен и внутриклеточный тирозинкиназный домен. Активация функции киназного рецептора происходит преимущественно посредством опосредованной лигандом гетеро- или гомодимеризации. В опухолевых клетках активация HER2 происходит независимо от лиганда за счет мутаций либо амплификации гена HER2. Гиперэкспрессия рецептора HER2 приводит к конститутивной активации сигнальных путей фактора роста и тем самым служит онкогенным фактором при различных типах злокачественных опухолей.
Амплификация гена HER2 встречается в 3 % всех случаев колоректального рака. При отсутствии мутаций в генах KRAS, NRAS, BRAF пациентам с метастатическим колоректальным раком рекомендовано определение копийности гена HER2 в целях возможности назначения анти-HER2-терапии.
Для чего используется исследование?
Для определения показаний к применению таргетной терапии анти-HER2-антителами.
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Патогенной амплификации гена HER2 не обнаружено: число копий Важные замечания
Для получения заключения по результату обследования необходимо проконсультироваться у врача-онколога.
Кто назначает исследование?
Определение HER2 статуса опухоли методом СISH
Описание
Определение HER-2 статуса опухоли методом CISH — исследование предрасположенности к развитию опухоли и подбор своевременного адекватного лечения при раке молочной железы (РМЖ) или раке желудка (РЖ).
HER-2 (HER-2/neu) — human epidermal growth factor receptor-2 — это белок, который может влиять на рост раковых клеток. Он создается специальным геном, который называется ген HER-2/neu. HER-2 является рецептором для определённого фактора роста, который называется человеческим эпидермальным фактором роста, естественным образом существующим у человека. Когда человеческий эпидермальный фактор роста прикрепляется к рецепторам HER-2 на раковых клетках груди, он может стимулировать рост и деление этих клеток. В здоровой ткани HER-2 передаёт сигналы, регулирующие пролиферацию и выживаемость клеток, но гиперэкспрессия HER-2 может обусловить злокачественную трансформацию клеток.
Гиперэкспрессия HER-2 при некоторых подтипах РМЖ ведёт к усилению пролиферации и ангиогенеза, нарушению регуляции апоптоза (генетически запрограммированного самоуничтожения клеток). Показано, что при раке молочной железы гиперэкспрессия этого рецептора в ткани опухоли ассоциирована с более агрессивным течением болезни, повышенным метастатическим потенциалом опухоли и менее благоприятным прогнозом. Открытие связи гиперэкспрессии HER-2 с неблагоприятным прогнозом РМЖ привело к поиску таких подходов к лечению, которые направлены на специфическое блокирование онкогена HER-2/neu (таргетная анти-HER2-терапия).
Рак молочной железы (РМЖ) — злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы. РЖМ занимает первое место среди всех злокачественных заболеваний у женщин.
В зависимости от наличия биологических маркёров опухоли — экспрессии гормональных рецепторов (эстрогена и/или прогестерона), экспрессии HER-2 — выделяют гормон-рецептор-положительный, HER-2-положительный и тройной негативный РМЖ.
HER-2/neu-положительные (HER-2+) типы рака молочной железы отличаются высокой экспрессией белка HER-2/neu.
HER=2/neu-негативные (HER-2-) типы рака молочной железы отличаются низкой экспрессией или отсутствием белка HER-2/neu.
Считается, что у одной из пяти женщин с раком груди опухоль является HER-2-положительной. Большинство раковых опухолей молочной железы являются гормонально-зависимыми: эстрогены и прогестерон оказывают на них стимулирующий эффект (пролиферативный и неопластический). При HER-2-положительном раке молочной железы на поверхности опухолевых клеток присутствует избыток HER-2-рецепторов. Данное явление носит название «положительный HER-2-статус» и диагностируется у 15–20% женщин, страдающих РМЖ.
HER-2 — рецептор эпидермального фактора роста человека 2-го типа, который присутствует в тканях и в норме, участвуя в регуляции деления и дифференцировки клеток. Его избыток на поверхности опухолевых клеток (гиперэкспрессия) предопределяет быстрый неконтролируемый рост новообразования, высокий риск метастазирования, низкую эффективность некоторых видов лечения. HER-2-положительный РМЖ является особенно агрессивной формой данного заболевания, поэтому точное определение HER-2-статуса имеет ключевое значение для выбора тактики лечения.
Рак желудка (РЖ) — злокачественная опухоль, происходящая из эпителия слизистой оболочки желудка.
РЖ занимает 4-е место в структуре онкологической заболеваемости и 2-е место в структуре онкологической смертности в мире. Заболеваемость РЖ у мужчин в 2 раза выше, чем у женщин. Россия относится к регионам с высоким уровнем заболеваемости РЖ и смертности от данного заболевания. Диагностика РЖ на ранних стадиях затруднена из-за длительного бессимптомного течения заболевания. Часто РЖ выявляют на поздних стадиях, когда 5-летняя выживаемость не превышает 5–10%, а единственным методом лечения остаётся химиотерапия.
Основным методом лечения РЖ является хирургический. Однако у большинства пациентов на момент постановки диагноза определяется распространённый опухолевый процесс, что делает невозможным выполнение радикальной операции и требует проведения системной лекарственной терапии. Проведение химиотерапии статистически достоверно увеличивает общую выживаемость больных метастатическим РЖ, улучшая качество их жизни.
Онкоген HER-2 (erbB-2) был первоначально идентифицирован в опухолях молочной железы. Амплификация и гиперэкспрессия данного гена является относительно специфическим событием для карцином молочной железы и практически не встречается в опухолях других локализаций. Рак желудка представляется одним из немногих исключений: активация HER-2 отмечается примерно в 10–15% злокачественных новообразований этого органа и коррелирует с агрессивным течением заболевания.
Гиперэкспрессия HER-2 является фактором неблагоприятного прогноза. По данным разных исследований, амплификация гена HER-2 у больных РЖ коррелирует с низкими показателями общей выживаемости.
Для оценки HER-2-статуса при РЖ и РМЖ используют СISH метод (хромогенная in situ гибридизация).
CISH — альтернативный нефлуоресцентный метод, при котором выявление гибридизованных ДНК-зондов происходит с помощью иммунопероксидазной реакции.
Необходимы гистологический протокол и иммуногистохимический протокол, стекло ИГХ.
Интерпретация результатов
HER-2 CISH определяет, есть ли повышенное количество (амплификация) гена HER-2 в клетках опухоли молочной железы.
Амплификации в опухоли
Амплификация генов — нарушение синтеза дочерних молекул ДНК, при котором вместо одной копии того или иного участка хромосомы образуется множество. Процесс представляет собой мутацию (один из вариантов хромосомных перестроек) — изменение их структуры и вызванные им внешние проявления.
Процесс амплификации генов часто происходит в клетках опухолей и никогда не встречается в нормальных. Если на амплифицированном участке находится ген, стимулирующий формирование и рост злокачественных новообразований (онкоген), это вызывает неконтролируемый рост атипичной ткани.
Примеры амплификации в опухоли
При исследованиях опухолей выявлен ряд закономерных амплификаций известных онкогенов:
Клиническая значимость амплификации в опухоли
Амплификация в ДНК опухоли повышает устойчивость раковых клеток к фармако- и химиотерапии. К примеру, при лечении метотрексатом, угнетающим активность дигидрофолатредуктазы, нередко появляются атипичные клетки, у которых этот фермент закодирован.
Амплификация в опухоли, как правило, повышает агрессивность течения заболевания: повышает число рецидивов, сокращает безрецидивный интервал, свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для жизни пациента. В подобных случаях по возможности используют таргетную терапию. При её проведении специфическими препаратами воздействуют на рецепторы онкогенов и подавляют их активность. Метод доказал свою эффективность в лечении ERBB2-амплифицированного рака молочной железы препаратом «Герцептин».
Степень амплификации (количественные изменения онкогенов) коррелирует со стадией развития опухоли.
Методы исследований амплификаций в опухоли
Для исследования количественных и качественных изменений в клетках при амплификации опухолей используют следующие методы:
Наряду с перечисленными исследованиями с помощью генетических маркеров определяют предрасположенность к тому или иному виду рака. Результаты комплексной молекулярной диагностики позволяют выбирать оптимальную терапевтическую тактику при амплификации в опухоли.
Амплификация в онкологии что это такое
ГБУ Ростовской области «Патологоанатомическое бюро», Ростов-на-Дону
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России
ГБУ Ростовской области «Патологоанатомическое бюро», Ростов-на-Дону
Амплификация гена как механизм возникновения клональной гетерогенности при раке молочной железы
Журнал: Архив патологии. 2019;81(6): 49-55
Павленко И. А., Завалишина Л. Э., Повилайтите П. Е. Амплификация гена как механизм возникновения клональной гетерогенности при раке молочной железы. Архив патологии. 2019;81(6):49-55.
Pavlenko I A, Zavalishina L É, Povilaĭtite P E. gene amplification as a mechanism of clonal heterogeneity in breast cancer. Arkhiv Patologii. 2019;81(6):49-55.
https://doi.org/10.17116/patol20198106149
ГБУ Ростовской области «Патологоанатомическое бюро», Ростов-на-Дону
Цель исследования — оценить выраженность гетерогенности амплификации гена HER2/neu при раке молочной железы (РМЖ) с положительным HER2/neu-статусом. Материал и методы. В образцах РМЖ с иммуногистохимической оценкой экспрессии HER2/neu2+ оценивали амплификацию гена HER2/neu и соотношение HER2/CEP17 методом FISH. Интерпретацию результатов проводили согласно рекомендациям ASCO/CAP2018г. РМЖ с наличием амплификации HER2/neu (n=25) оценивали на предмет вариабельности амплификации HER2/neu и HER2/CEP17 в учтенных при методе FISH 20 опухолевых клетках. Результаты. Обнаружена существенная внутриопухолевая вариабельность количества копий HER2/neu и показателя HER2/CEP17. В 28% исследованных образцов с положительным HER2/neu-статусом присутствовали клетки с отрицательным HER2/neu-статусом в количестве 5—15%. Для этих опухолей показатели количества копий гена HER2/neu и соотношения HER2/CEP17 были статистически значимо ниже, чем в группе, в которой все учтенные клетки характеризовались наличием амплификации HER2/neu: 6,25 (95% ДИ 4,3—12,45; p=0,0166) и 2,37 (95% ДИ 2,06—3,43; p=0,0076) соответственно. Пороговое значение HER2/CEP17, при котором в опухоли c положительным HER2/neu-статусом обнаруживаются клетки без амплификации, — 2,5. Заключение. Амплификация HER2/neu при РМЖ чрезвычайно вариабельна как в пределах одной опухоли, так и между опухолями одного биологического подтипа. Гетерогенность амплификации статистически значимо чаще присутствует в HER2/neu-положительных РМЖ с соотношением HER2/CEP17
Введение
Современная онкология рассматривает HER2/neu как важное звено патогенеза развития рака молочной железы (РМЖ) [1]. Точечные мутации этого гена встречаются редко, однако амплификация наблюдается приблизительно в 15% случаев РМЖ. Опухоли с амплификацией HER2/neu, или HER2/neu-положительные РМЖ принадлежат к двум молекулярно-генетическим подтипам РМЖ: люминальному В- и HER2 (+)-подтипу [2].
Хорошо известно, что HER2-положительные РМЖ при отсутствии терапии характеризуются агрессивным течением, ранним метастазированием, низкой безрецидивной и общей выживаемостью [1, 2]. Таргетная (target — мишень) терапия гуманизированными моноклональными антителами к белку HER2/neu, такими как трастузумаб и пертузумаб, значительно увеличивает частоту полных патоморфологических регрессий опухолей, снижает риск рецидива, прогрессии и смерти от заболевания [3]. Прорыв в лечении HER2/neu-положительных опухолей привел к тому, что общепринятым методом оценки чувствительности к таргетной терапии стало определение статуса HER2/neu в рамках первичной диагностики РМЖ. На первом этапе HER2/neu-тестирования проводится скрининговое иммуногистохимическое (ИГХ) исследование экспрессии HER2. Результаты ИГХ-реакции оценивают в баллах от 0 до 3+. Опухоли с оценками 0 и 1+ считаются негативными и не подлежат лечению таргетными препаратами, 2+ имеют неопределенный результат, требующий проведения исследования амплификации гена HER2/neu с помощью гибридизации in situ (ISH), 3+ – HER2/neu-положительные опухоли. На следующем этапе проводится определение амплификации гена HER2/neu методом ISH (fluorescence in situ hybridization — FISH или его аналогами). При подтвержденной амплификации HER2/neu (в случаях, когда ИГХ-исследование опухоли дало оценку 3+ или амплификация гена была определена методом ISH) больным показано назначение одного из вариантов таргетной терапии с использованием различных анти-HER2/neu-препаратов. Стандарты HER2/neu-тестирования, в которых прописан четкий алгоритм его проведения и интерпретации результатов, изложены в рекомендациях Американского общества клинической онкологии и Коллегии американских патологов (ASCO/CAP) [4]. Рекомендации ASCO/CAP корректируются раз в несколько лет, если новые исследования дают основания к пересмотру этого документа. Так, например, по сравнению с рекомендациями ASCO/CAP 2013 г. [5] обновленные рекомендации 2018 г. коснулись достаточно редко встречающихся, но сложных для однозначной трактовки результатов ISH. Алгоритм HER2/neu-тестирования изменился в следующих случаях, если при ISH:
— соотношение HER2/CEP17 ≥2 и среднее количество копий гена HER2/neu 
Рис. 1. Вариабельность количества копий гена HER2/neu у пациентов с амплификацией HER2/neu (n=25). Каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует подсчитанному значению HER2/neu в одном опухолевом ядре. 
Рис. 3. Вариабельность отношения HER2/CEP17 у пациентов с амплификацией HER2/neu (n=25). Каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует вычисленному значению HER2/CEP17 в одном опухолевом ядре. графики значений медиан и 95% ДИ (рис. 2, 4). 
Рис. 2. Медианы и 95% доверительные интервалы количества копий гена HER2/neu в каждом опухолевом ядре (n=20) образцов РМЖ с амплификацией HER2/neu. 
Рис. 4. Медианы и 95% доверительные интервалы соотношения HER2/CEP17 в каждом опухолевом ядре (n=20) образцов РМЖ с амплификацией HER2/neu. На диаграмме рассеяния количества копий гена HER2/neu очевидны не только значительная вариабельность этого показателя в каждой конкретной опухоли, но и отличия опухолей друг от друга (см. рис. 1). Лишь в опухолях нескольких пациентов расположение точек (каждая точка соответствует подсчитанному значению HER2/neu в одном опухолевом ядре) на диаграмме достаточно компактное. То же самое наблюдается в отношении HER2/CEP17 (см. рис. 3). На графиках значений медиан и 95% ДИ (см. рис. 2, 4) точками обозначены медианные показатели HER2/neu и HER2/CEP17, а «усы» обозначают границы 95% ДИ и почти всегда асимметричны, что указывает на отклонение распределения признаков от нормального. Ширина 95% ДИ (размах «усов») свидетельствует о большой вариативности показателей. Существенные отличия количества копий гена HER2/neu между опухолевыми клетками, находящимися в непосредственной близости друг от друга, отмечены многими исследователями [8, 12, 13]. Наиболее вероятное объяснение такой неоднородности амплификации HER2/neu — повторяющиеся BFB-циклы (Breakage-Fusion-Bridge), лежащие в основе механизма амплификации генов. Каждый BFB-цикл начинается с двухцепочечного разрыва ДНК с последующим образованием нестабильной дицентрической хромосомы, в которой во время анафазы митоза происходит следующий двухцепочечный разрыв [14]. Поскольку количество таких разрывов, как и самих BFB-циклов, в каждой клетке абсолютно случайно, это приводит к вариабельности амплификации, визуально определяющейся методом FISH.
На графиках обращает на себя внимание не только тот факт, что 95% ДИ демонстрируют широкую вариабельность показателей, но и то, что в ряде случаев 95% ДИ вообще не перекрываются друг с другом. Это может указывать на статистически значимые различия между группами. Действительно, при сравнении медианных значений 25 групп между собой с помощью критерия Краскела—Уоллиса установлены достоверные различия как между количеством копий HER2/neu, так и соотношением HER2/CEP17 у разных пациентов (Н(24)=232,4; р –(3,2—1,3 x )), где у — вероятность наличия в HER2-положительной опухоли клеток без амплификации, х — среднее значение отношения HER2/CEP17 в 20 клетках этой опухоли. Данная зависимость статистически значима: критерий отношения правдоподобия G(1) = 3,8942; р=0,00485.
Пороговое значение HER2/CEP17, при котором в опухоли c положительным HER2/neu-статусом обнаруживаются клетки без амплификации (не важно, в каком количестве), составляет 2,5. Так как во всех проанализированных РМЖ отношение HER2/CEP17 ≥2, а количество копий гена HER2/neu ≥4 (в большинстве случаев 6 и более), они, бесспорно, относятся к категории HER2/neu-положительных, при этом больным показана наиболее эффективная для них таргетная терапия. Однако является ли феномен неоднородности амплификации клинически незначимым?
Применение таргетной терапии при РМЖ — один из великолепных примеров успеха персонализированной медицины и огромный прорыв в онкологии. Использование таргетных препаратов существенно ограничено первичной или приобретенной резистентностью, в основе которой лежит множество факторов, в том числе и генетическая гетерогенность опухоли. Существование генетической гетерогенности — пространственной и временно́й — отличительная черта РМЖ, что отмечается во многих исследованиях [9, 15, 16]. Вероятно, появление нескольких субклонов в пределах одной опухоли является одним из способов изменения ее злокачественного потенциала [17]. В нескольких ретроспективных исследованиях показано, что гетерогенные РМЖ ассоциированы с плохим прогнозом [18, 19]. Авторы объясняют прогрессию заболевания существованием резистентных к терапии субклонов опухоли, получающих конкурентное преимущество на фоне проводимого лечения. Поэтому определение и характеристика таких клонов имеют не только научный интерес, но и непосредственное отношение к прогнозу течения и выбору тактики лечения заболевания.
Определение мутационного статуса различных субклонов опухолей, которое стало возможным благодаря появлению методов полногеномной амплификации и секвенирования нового поколения, убедительно продемонстрировало существование в каждом из них совершенно особых генетических аберраций. Так, клетки без амплификации HER2/neu могут отличаться наличием амплификации других генов — BRF2(8p11-p12) и DSN1(20q13), а также соматическими мутациями HER2/neu [7]. Мутации PIK3CA в HER2/neu-положительных РМЖ с гетерогенной экспрессией HER2/neu также встречаются в тех клетках, где амплификации HER2/neu не наблюдается [20]. Клиническое значение обнаружения этих генетических аберраций пока неясно, но то, что различия между опухолями с разной долей HER2/neu—отрицательных опухолевых клеток в основной популяции с амплификацией HER2/neu существуют, продемонстрировано в нескольких работах. Так, например, показано, что РМЖ с высокой вариабельностью количества копий гена HER2/neu и присутствием клеток без амплификации на фоне доминантной HER2/neu-положительной опухоли имеют более высокий риск прогрессии и развития отдаленных метастазов по сравнению с гомогенными по амплификации HER2/neu-положительными опухолями, а также опухолями с отрицательным HER2/neu-статусом [21]. Эти РМЖ, по-видимому, очень близки описанным M. Ballard и соавт. [22] опухолям с «неклассическими» результатами FISH. Авторы отнесли к ним среди прочих РМЖ с низкой амплификацией, а именно те опухоли, которые при соотношении HER2/CEP17 ≥2 имеют среднее количество копий гена HER2 на ядро от 4 до 6. Проанализировав данные 8000 пациентов, исследователи обнаружили, что время до прогрессирования таких опухолей статистически значимо меньше, чем опухолей с «классической» амплификацией.
Следует отметить, что градации низкой амплификации отличаются в разных исследованиях. Например, в работе А. Borley и соавт. [23] это опухоли с количеством копий гена HER2/neu на клетку от 6 до 12. Авторы отмечают, что они резистентны к таргетной терапии в адъювантном режиме и имеют плохой прогноз по сравнению с РМЖ с более высоким количеством копий HER2/neu. Анализируемая выборка при соотношении HER2/CEP17 ≥2 содержит 6,25 (95% ДИ 4,3—12,45) копии гена HER2/neu на ядро, т. е. соответствует описанным в исследовании [23] опухолям с низкой амплификацией. Хотя причины неэффективности терапии авторами в этой работе не обсуждаются, считаем, что гетерогенность амплификации HER2/neu может играть здесь определенную роль. Амплификация HER2/neu, вероятно, вносит значительный вклад в появление опухолевых клонов de novo, генетическое и клональное разнообразие РМЖ. Таргетная анти-HER2/neu-терапия, действуя на чувствительные к ней HER2/neu-позитивные клетки, может способствовать селективному отбору минорных субклонов с отрицательным HER2/neu-статусом и прогрессии заболевания. В случаях, которые ранее интерпретировались как неопределенные в отношении амплификации HER2/neu (согласно рекомендациям ASCO/CAP, 2013), гетерогенность амплификации, возможно, выражена гораздо сильнее, чем в опухолях с положительным HER2/neu-статусом.
Заключение
Таким образом, амплификация HER2/neu при РМЖ чрезвычайно вариабельна как в пределах одной опухоли, так и между опухолями одного биологического подтипа. Более того, наличие в образце опухоли клона с амплификацией HER2/neu не исключает присутствия минорных субклонов с отрицательным HER2/neu-статусом, которым могут быть присущи другие генетические аберрации. Если при FISH-исследовании с двойной флюоресцентной меткой обнаружена амплификация гена HER2/neu и при этом соотношение HER2/CEP17 составляет 2≤ HER2/CEP17
Определение HER-2/neu при раке желудка
Иммуногистохимия (ИГХ) – метод выявления точной локализации того или иного клеточного или тканевого компонента (антигена) благодаря связыванию его с мечеными антителами. Для проведения иммуногистохимического исследования используются фрагменты ткани опухоли, удаленной хирургическим путем или полученные в результате биопсии. ИГХ-исследование позволяет определить тип низкодифференцированной опухоли, гистогенетическую принадлежность, наличие в ткани опухоли специфических рецепторов гормонов, других сигнальных молекул. Иммуногистохимия востребована при дифференциальной диагностике опухолей, определении источника метастаза при неясном первичном очаге, оценке гормонального статуса опухоли, иммунофенотипировании опухолей, определении факторов прогноза опухолевого процесса и для адекватного выбора схемы химиотерапевтического лечения.
Онкобелок HER2/neu (Human Epidermal growth factor Receptor 2) –трансмембранный гликопротеин, который является представителем семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR). У человека рецептор HER2/neu выявляется в нормальных тканях, однако его гиперэкспрессия характерна только для опухолевых клеток. Определение НER2/neu статуса опухоли необходимо для определения прогноза и выбора схемы лечения. Для оценки статуса HER2/neu при раке желудка используются методики, принятые при исследовании опухолей молочной железы (ИГХ, гибридизация in situ), однако опухоли желудка отличаются более высокой частотой неполного мембранного окрашивания при ИГХ. Корреляция гиперэкспрессии белка и амплификации гена HER2/neu составляет в среднем 90%.
Биоматериал: микропрепараты (блок + стекло).
Метод анализа: иммуногистохимический.
Заключение. Выдается заключение о HER2/neu-статусе опухоли: положительный или отрицательный. Целесообразно дополнительно проводить определение амплификации гена HER2 методами in situ гибридизации (CISH) (см.220018).