какую часть головного мозга берут для проведения лабораторной диагностики на гэ крс

по диагностике губкообразной энцефалопатии

крупного рогатого скота

Глава 1. Общие положения

1. Инструкция по диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота

2. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота (бешенство коров, бычья спонгиоформная энцефалопатия) – медленно развивающаяся болезнь с поражением центральной нервной системы, относящаяся к прионным (медленным) инфекциям или группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатий млекопитающих. Это медленно протекающие инфекции, при которых макроорганизм не отвечает иммунологической реакцией. К ним относятся скрепи овец, энцефалопатия норок, энцефалопатия кошек, хроническая изнуряющая болезнь мулов, оленей и лосей, энцефалопатия экзотических копытных животных (антилопы и других), а также болезнь Крейнцфельдта-Якоба, куру, летальная семейная бессонница, синдром Герстмана-Штрейсслера-Шейнкера у человека. Для спонгиоформных энцефалопатий характерно, что возбудитель их может первоначально реплицироваться, не вызывая гибели чувствительных клеток. При этом патологические изменения проявляются поздно и только в центральной нервной системе, но не сопровождаются воспалительной реакцией.

Каждая из энцефалопатий имеет сходное прогрессирующее клиническое течение с неизбежным летальным исходом и сходные гистопатологические изменения (вакуолизация нейронов, пролиферация и гипертрофия астроглии без признаков воспалительной реакции, которая обычно встречается при других инфекциях.

90-процентный водный раствор фенола, однако, 8М раствор мочевины и 0,01 М раствор перйодата калия существенно снижают их активность.

4. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота появилась в результате скармливания крупному рогатому скоту мясо-костной муки, полученной при переработке туш овец, пораженны скрепи.

Глава 2. Клинические признаки заболевания

5. Инкубационный период при губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота составляет от 3 до 8 лет. Первые симптомы обычно появляются в возрасте от 4 до 5 лет, постепенно усиливаясь в течение 1-4 месяцев. Продолжительность заболевания варьирует от 2 недель до 1 года и более. У животных, пораженных этим заболеванием, отмечают симптомы общего и неврологического характера.

6. Неврологические симптомы бывают трех типов.

6.1. У животных наблюдаются изменения в поведении, чаще всего сходные со страхом, нервозностью, особенно при входе в помещение и выходе из него, агрессивность (попытки к нападению или появление свирепости), скрежет зубами, беспокойство, боязливость, стремление отделиться от стада, возбудимость, дрожание отдельных участков тела (мышц нижнего отдела шеи и плечевой области, губ, зеркальца, век, ушей) или всего тела, нераспознавание препятствий, пугливость при загоне через узкие проходы, лягание при нормальном обращении (молочный скот), частые движения ушами, облизывание носа, почесывание головы ногой, но без выраженного зуда, как при скрепи овец. В некоторых случаях при пальпировании пояснично-крестцового

отдела наблюдается «эффект хруста», движение губ и вытягивание шеи.

6.2. Двигательные расстройства: нарушение координации движений, внезапные быстрые сокращения отдельных мышц или их групп, избыточная подвижность, утрата нормальной походки, рысистые движения, скольжение, загребание передними ногами, подкашивание задних ног при быстром повороте, поднятый хвост и падения, спина дугообразно изогнута, при движении, наоборот, позвоночник вогнут, хвост поднят.

Нарушения становятся заметнее при напряжении или быстрой ходьбе и, наконец, могут привести к тому, что животное постоянно лежит и не может встать.

6.3. Изменение чувствительности, которая проявляется в различных видах, но чаще всего речь идет о гиперчувствительности при прикосновении, действии шума и света.

Кроме этих признаков, изменяется общее состояние животных, они худеют, снижаются удои, аппетит сохраняется, но животные с трудом поедают корм.

Указанные выше симптомы могут наблюдаться в разных сочетаниях с различной степенью выраженности. Повышения температуры не отмечают. Болезнь всегда прогрессирует и заканчивается летально. Клинические признаки могут вызвать подозрение на болезнь, но для постановки окончательного диагноза на губкообразную энцефалопатию необходимо

подтверждение предварительного диагноза другими методами, в первую очередь гистологическим методом.

Глава 3. Патологоанатомические и гистологические изменения

Вестибулярные ядра и красное ядро также часто содержат крупные, отчетливо различимые единичные или множественные цитоплазматические вакуоли.

8. Характерные изменения отмечаются при гистологическом исследовании. При этом выявляются двусторонние симметричные дегенеративные изменения в некоторых участках серого вещества ствола головного мозга. В нейропиле отмечается умеренное количество дискретно овоидных вакуолей или микрополостей. Нейрональные перикарионы и асконы ядер ствола мозга содержат крупные, хорошо ограниченные внутрицитоплазматические вакуоли, которые бывают единичными или множественными, иногда явно растягивая сому клеток, образуя нейроны с узкой полоской цитоплазмы. Содержимое вакуолей не окрашивается и остается прозрачным при окраске на гликоген в парафиновых срезах и на липиды в криосрезах. Сходные изменения отмечаются при скрепи овец, болезни Крейнцфельдта-Якоба человека и других губкообразных энцефалопатиях человека и животных.

Глава 4. Эпизоотологические особенности губкообразной энцефалопатии

крупного рогатого скота

9. Причиной возникновения эпизоотии губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота явилась мясо-костная мука, содержащая белки больных жвачных животных. Имеется риск для телят, родившихся от больных коров в течение 3 лет после прекращения скармливания мясо-костной муки.

10. Чувствительность к заражению животных губкообразной энцефалопатией в значительной степени зависит от индивидуальной предрасположенности к возбудителю. Вероятность заболевания теленка, родившегося от пораженной коровы, намного выше, чем у теленка, родившегося от здоровой коровы. Из-за длительного инкубационного периода сложилась такая ситуация, при которой находившийся в кормах возбудитель мог в течение 3-8 лет инфицировать восприимчивую субпопуляцию крупного рогатого скота, вызывая губкообразную энцефалопатию без проявления клинических признаков.

Глава 5. Диагностика губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота

11. Установление диагноза на губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота включает:

11.1. изучение клинических признаков;

11.2. изучение эпизоотологической ситуации;

11.3. проведение патогистологических исследований;

11.4. проведение электронно-микроскопического исследования;

11.5. проведение иммунохимических исследований (иммуноблотинг);

11.6. проведение биопробы на лабораторных животных.

12. Для диагностических исследований в специализированную лабораторию по изучению губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота посылают: мозг крупного рогатого скота после исследования на бешенство, другие вирусные инфекции и отравления после неподтверждения диагноза; мозг крупного рогатого скота из мясокомбинатов (0,01% от забитых животных старше 3 лет).

Глава 6. Порядок отбора проб мозга для диагностических исследований

13. Диагностика губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота проводится только после гибели или вынужденного убоя животных. В этой связи важным условием являются правильный отбор проб, их фиксация, транспортировка и хранение.

14. Патологический материал (головной мозг) берут от животных с клиническими признаками поражения центральной нервной системы. При этом головной мозг для гистологических, электронно-микроскопических и иммунохимических исследований необходимо брать у животных сразу после их убояили гибели до наступления лизиса тканей или размножения другой сопутствующей микрофлоры.

15. Для извлечения мозга у крупного рогатого скота необходим инструментарий согласно приложению 1.

17. Голову отделяют от шеи по атланто-затылочному сочленению. Труп животного сбрасывают в забетонированную яму Беккари глубиной не менее 3 метров и засыпают хлорной известью. Наиболее эффективным способом утилизации трупов является их сжигание. Отделенную от трупа голову упаковывают в металлическую пленку, помещают в металлический контейнер, желательно со льдом, транспортируют при температуре +2-15°С в ветеринарную лабораторию или специализированную лабораторию по изучению губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота.

18. Голова должна быть доставлена в исследовательскую лабораторию втечение12-36 часов, поскольку в результате размножения микроорганизмов в тканях мозга или автолиза мозг становится непригодным для гистологического исследования. Замороженный при транспортировке или при хранении в холодильнике головной мозг также непригоден для проведения анализа, так как в результате замораживания возникают артефакты, мешающие диагностике. При длительной транспортировке или в жаркую погоду целесообразно в контейнер положить лед.

19. Сразу после доставки в исследовательскую лабораторию с дорсальной части головы крупного рогатого скота удаляют кожу. Имеется два способа извлечения головного мозга из черепной коробки.

20. Фиксацию мозга осуществляют следующим образом.

Учитывая особенность проявления губкообразной энцефалопатии (отечность и расплавление нейроглии), фиксация мозга должна быть экстренная и жесткая, позволяющая исключить артрефакты и обеспечить максимально достоверную диагностику.

20.1. Для фиксации головного мозга путем использования несплошных поперечных разрезов на извлеченном головном мозге необходимо сделать несплошные поперечные разрезы в виде пластин толщиной 5-8 мм (схема участков головного мозга и его разрезов согласно приложениям 3 и 4). Более толстые пластины делать нельзя, так как формалин проникает и фиксирует ткани только на толщину не более 8 мм. Между пластинами ткани проложить гигроскопический

материал (вату, марлю, фильтровальную бумагу).

20.2. Для фиксации головного мозга его целиком помещают в фиксирующий раствор в соответствии с пунктом 19 настоящей

20.3. Зафиксированный мозг помещают в ударопрочную емкость, при этом объем фиксирующего раствора должен быть в 10 раз больше объема мозга. В таком виде материал должен храниться не менее 2 недель, после чего его необходимо доставить в лабораторию вирусных и прионных инфекций крупного рогатого скота

Глава 7. Патогистологическая диагностика

21. Сущность метода заключается в микроскопическом определении степени выраженности и характера изменений в головном мозге животных, пораженных губкообразной энцефалопатией крупного рогатого скота.

23. Патологогистологическую обработку материала проводят в следующей последовательности.

23.1. Взятие материала. Взятие материала от животных производят из фиксированного мозга в соответствии с пунктами 18 и 19 настоящей Инструкции. Вырезают кусочки зафиксированных тканей мозга в виде пластинок не толще 0,5-1 см из различных участков органа.

23.2. Фиксация материала. Патологический материал обязательно должен быть этикетирован и зафиксирован немедленно и непосредственно после взятия (но не позднее 12 часов). Категорически запрещается патологический материал замораживать.

23.3. Уплотнение материала. Уплотнение материала проводят при помощи прозрачных сред (целлоидина, парафина).

Уплотнение материала проводят в основном путем заливки в прозрачные среды (парафин, целлоидин). Для заливки материала в парафин необходимы: спирты (50, 60, 70, 80, 90, 100°), 100°-й хлороформ, хлороформ, хлороформ-парафин и парафин (2-3 порции).

Разведение спиртов проводят согласно приложению 6 к настоящей Инструкции.

Абсолютный (100°) спирт приготавливают путем добавления к 96° спирту безводного медного купороса (порошок серовато-белого цвета).

Прокаленный купорос гигроскопичен, поэтому его хранят в банке или склянке с притертой пробкой. После охлаждения он пригоден к работе.

Процесс прокаливания медного купороса нужно вести в вытяжном шкафу, а при отсутствии последнего пользоваться ватно-марлевыми повязками.

В банку или склянку наливают необходимое количество спирта, затем добавляют обезвоженный медный купорос из расчета 10-15 процентов к объему спирта в течение 1-2 суток, периодически энергично встряхивают. Белый цвет порошка переходит в голубой вследствие поглощения купоросом воды. Этот процесс повторяют несколько раз до тех пор, пока после внесения спирта порошок не приобретет синее окрашивание, каждый раз сливая спирт в чистую посуду. Готовый абсолютный спирт переливают в чистую сухую емкость, после чего он годен к работе.

Парафин поступает, как правило, гомогенизированный. Для придания ему пластичности в расплавленный парафин рекомендуется добавлять пчелиный воск до 5 процентов, что облегчает получение качественных и тонких срезов.

Кусочки мозга толщиной 0,5 см выдерживают в каждом из реагентов по 3-4 часа, при использовании автомата для гистологической обработки тканей типа АТ-4 или АТ-5; затем в хлороформ-парафине 2-3 часа при температуре 37°С; парафине I и II по 45-60 минут при температуре 58-60°С. После этого заливают в формочки (чашки Петри) новую порцию парафина и помещают в него кусочки.

После появления достаточно плотной пленки застывшего парафина формочки с кусочками мозга погружают в емкость с холодной водой для равномерного охлаждения и уплотнения.

Не рекомендуется ставить формочки в холодильник, так как при очень быстром охлаждении нарушается структура парафина, который получается крошковатым и плотным. При соблюдении приведенных условий парафин после заливки представляет однородную массу. Наличие пузырей воздуха, молочно-белых зернистых участков свидетельствует о

недостаточном удалении промежуточных сред или неравномерном охлаждении. Если проведено неудовлетворительное обезвоживание или заливка охлажденным парафином и кусочки материала будут вылущиваться из парафина, необходимо освободить кусочки от парафина и залить их вторично (начиная со спирт-хлороформа).

В последующем вырезают прямоугольные блоки, оставляя вокруг кусочка слой парафина шириной 1-1,5 мм. Для наклеивания блоки кладут на деревянный кубик и вдвигают между ними горячий шпатель. Дополнительно оплавляют по краям этим же шпателем. Блоки должны соответствовать колодкам и не выступать за их края. Деревянные кубики готовят из твердых пород дерева (березы, бука), можно из паркетных дощечек.

Метод заливки патологического материала в целлоидин из-за его дефицита, длительности и трудоемкости в практических условиях используется редко.

23.4. Изготовление срезов (микротомирование):

23.5. Парафиновые срезы готовят следующим образом:

23.5.1. парафиновый блок (на колодке) зажимают в объектодержатель микротома перпендикулярно к ножу;

23.5.2. при помощи рукояток переместить рамки объектодержателя так, чтобы поверхность блока была горизонтальной ножу;

23.5.4. установить микровинт на деление 20-30 микрон, подвести блок до легкого соприкосновения с ножом и закрепить, произвести грубую зачистку блока, чтобы обнаружилась ткань кусочка, краем ножа;

23.5.6. подвести объектодержатель с блоком до легкого соприкосновения с ножом, закрепить его;

23.5.7. изготовить гистосрез.

Качество срезов зависит от величины и плотности объекта, твердости парафина, окружающей температуры и других факторов. Поэтому в одних случаях срезы получаются при быстром толчкообразном, в других, наоборот, при медленном и равномерном движении ножа. При изготовлении парафиновых срезов возможны дефекты согласно приложению 7 к настоящей Инструкции;

23.5.8. полученные срезы при помощи мягкой кисточки (слегка смоченной водой) или препаровальной иглы снимают с ножа и переносят на планшет или гладкую бумагу (лучше черную). Срезы подписывают с указанием объекта, с которого получены срезы, или напротив среза располагают соответствующий блок, с которого он сделан.

Перед расправлением срезов предварительно на обезжиренные предметные стекла наносят белковый клей, предназначенный для прикрепления их к стеклам;

23.5.9. для приготовления клея используют свежий яичный белок без примесей. 2 части белка взбивают тщательно вилкой до состояния пены, добавляют1часть глицерина, 1 кристаллик камфоры или тимола и размешивают.

Смесь готова к использованию через 1-2 дня. На предметное стекло наносят маленькую каплю клея, растирают пальцем

досуха и проносят над пламенем спиртовки 3-5 раз, пока не исчезнет помутнение на стекле.

Для расправления срезы переносят в емкость (чашку, бобовидный тазик) с теплой (46-48°С) дистиллированной водой, температуру контролируют термометром и расправляют. Более горячая вода приводит к расплавлению парафина. Лучше использовать спирт 70°С. Срезы кладут на воду или спирт той стороной, которая была обращена к ножу;

23.5.10. характер расправления серийных срезов несколько иной. Серию срезов вначале плавно подносят к краю емкости, затем несколько ускоренным движением вперед касаются воды нижним краем и при таком же движении вдоль краев чашки опускают на воду поочередно следующие срезы. Подготовленное ранее предметное стекло опускают концом в воду, подводят под срезы и подхватывают их препаровальной иглой за один из краев, затем плавно вынимают из воды стекло вместе со срезом. Остатки воды вокруг среза удаляют фильтровальной бумагой, ставят стекла вертикально в подставки и оставляют для сушки на несколько часов при комнатной температуре во избежание отклеивания их во время окраски. Допускается при небольшом количестве патологического материала изготовление замороженных срезов.

23.6. Окрашивание гистосрезов проводят в следующей последовательности:

23.6.1. окрашивание проводится с целью оптической дифференцировки структурных элементов тканей. Используемые в

гистологической технике краски делятся: на основные (ядерные, кислые (цитоплазматические, фоновые), нейтральные и специальные.

Из группы основных красок наибольшее применение имеют приготовленные из гематоксилина. Наиболее употребительными являются гематоксилин Эрлиха и гематоксилин Бемера;

Такой раствор фильтруют и хранят в плотно закрытой посуде. Срезы окрашивают в течение 3-5 минут;

23.6.3. гематоксилин Бемера готовят следующим образом: 40 г алюмокалиевых квасцов растворяют в 400 мл дистиллированной воды при нагревании, охлаждают и фильтруют в широкий стакан, затем добавляют 20 мл 10%-го спиртового раствора гематоксилина (на 96°-м спирте), завязывают марлей и оставляют для созревания, как и гематоксилин

При приготовлении гематоксилинов все компоненты добавляют в указанной последовательности после растворения предыдущего реактива. Перед каждым употреблением гематоксилин необходимо фильтровать во избежание выпадения осадков в срезах;

23.6.4. из кислых красок постоянное применение имеет эозин К (калий) или Н (натрий) в 0,25-0,5-процентных водных растворах. Концентрацию рабочего раствора определяют опытным путем. Для этого окрашивают несколько срезов в различных растворах краски (0,1; 0,2; 0,3% и так далее) в течение 2-5 минут, проверяют под микроскопом степень окрашивания и устанавливают оптимальную концентрацию. Все краски для гистологических работ готовят только надистиллированной воде.

23.7. Окраска срезов гематоксилин-эозином.

23.7.2. Окраску гистосрезов проводят в следующем порядке:

промывка в водопроводной воде 60-90 секунд;

дифференцировка в солянокислом спирте (1-процентный раствор соляной кислоты в 70°-м спирте) до появления розового цвета срезов (30-60 секунд);

промывка в водопроводной воде (лучше в двух порциях) 3-5-10 минут до посинения срезов;

промывка в дистиллированной воде 40-60 секунд;

обезвоживание в спиртах возрастающей крепости (70°, 96°, 100°) по 1 минуте;

просветление гистосрезов в карбол-ксилоле 2 минуты;

окрашенные гистосрезы переносят в ксилол на 1-2 минуту, после чего заключают в бальзам.

Для просветления срезов используют карбол-ксилол в соотношении 1:4-1:10 (по объему). Для этого расплавляют в термостате (при 56-60°) кристаллическую карболовую кислоту (фенол) и смешивают с ксилолом, который также предварительно ставят в термостат.

23.8. Для заключения срезов под покровное стекло чаще применяется канадский или пихтовый бальзам;

23.8.2. при заключении срезов каплю бальзама наносят на предметное стекло под углом 45°С и, когда бальзам растечется по краю, плавно его опускают на срез, поддерживая противоположный край иглой. Излишки бальзама удаляют со стекла салфеткой или тряпочкой, слегка смоченной ксилолом. Препарат кладут на планшет горизонтально на 24-48 часов, желательно под груз. Стекла этикетируют. Подписи делают тушью или чернилом по стеклу. При этом методе окраски ядра

24. Характерные (патогномоничные) для губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота признаки согласно приложениям 8-10:

— диффузная вакуолизация и расплавление нейроглии (в виде множественных разной формы и величины сот);

— коагуляция цитоплазмы в нейронах, проявляющаяся в виде плотного сгустка с повышенной оксифильностью (красного

— наличие пикноза, рексиса и частичного лизиса ядер нейронов,иногда криброза цитоплазмы (множественные мелкие вакуоли);

— гипертрофия эндотелия кровеносных сосудов с явлениями кариопикноза и репсиса);

— наличие периваскулярных круглоклеточных астроцитных и макрофагальных элементов типа негнойного энцефалита (напоминающие «висна» у овец);

— явления вакуолизации нейронов (перстневидные клетки) встречаются редко и слабо выражены, тогда как при «скрепи» у овец они носят более выраженный характер;

— наличие вокруг нейронов явлений отека и вакуолизации;

24.1. подтвержденным на губкообразную энцефалопатию крупногорогатого скота диагноз следует считать только на основании комплексного анализа эпизоотологических, клинико-анатомических и патогистологических исследований. При этом следует сравнивать гистопрепараты отделов головного мозга, полученных от заведомо здоровых животных (контроль);

24.2. сомнительным считается диагноз при наличии ассиметричных признаков вакуолизации в нейроглии или в нейронном околоядерном пространстве;

24.3. отрицательный диагноз ставится в случае отсутствия гистологических изменений в основных участках головного мозга, необходимых для диагностики, согласно приложениям 11-13), а при подозрении и остальных участков мозга;

24.4. Дополнительными методами диагностики губкообразной энцефалопатии являются электронно-микроскопический метод, иммуноблотинг, а также иммуногистохимический метод выявления патологических PrP-белков в обычных, фиксированных в формалине срезах, который проводится Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты животных (г.Владимир, Российская Федерация).

Глава 8. Электронно-микроскопический метод исследований

25.1. Исследования проводят в следующем порядке:

приготовление исходных концентрированных и рабочих растворов;

обработка исследуемых проб;

25.3. Постановка реакции проводится в следующем порядке:

25.3.1. в исследуемой ткани мозга (лобная, височная, затылочная, теменная части коры полушарий большого мозга, кора мозжечка) делают срез длиной не менее 1 см;

25.3.3. в 3 чашки Петри вносят по 200 мкл растворов ДСН, трипсина и протеиназы К соответственно. Полученные на сеточках мазки-отпечатки накладывают отпечатком вниз в капли соответствующих растворов, накрывают крышкой, помещают в термостат и инкубируют в течение 30 минут при 37°С;

25.3.4. для каждого вида обработки используют по 4 электронно-микроскопические сеточки. Отдельные сеточки проводят последовательно через обработку всеми тремя реагентами;

25.3.5. после обработки сеточки промывают дистиллированной водой (5 раз по 30 секунд);

25.3.6. для контрастирования сеточки с мазками-отпечатками помещают в 5-процентный раствор уранил ацетата на 15-20 минут, затем интенсивно промывают под проточной дистиллированной водой и высушивают на фильтровальной бумаге;

25.3.7. исследование мазков-отпечатков проводят на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 15000-60000;

25.3.8. учет результатов проводят путем сравнительного электронно-микроскопического изучения мазков-отпечатков мозга в сочетании с обработкой ДСН, трипсином и протеиназой К, что позволяет идентифицировать САФ из общего пула трубчато-филаментозных образований, выявляемых в ЦНС. При этом, чем более выражена «жесткость» ферментативной обработки, тем ниже вероятность ошибки и выше возможность обнаружения таких специфических фибриллярных

«жесткости» ферментативной обработки в пределах от 100-200 нм до 1,5-2 микрон. Реже PrP-структуры могут быть представлены отдельно лежащими глобулами, палочками и/или другими палочковидными структурами. Обнаружение протеазо-устойчивых структур свидетельствует о наличии прионовой инфекции в ЦНС.

26. Выявление прионовых палочек в тканях центральной нервной системы методом негативного контрастирования осуществляют путем их ферментативного выделения с последующим просмотром под электронным микроскопом.

26.1. Исследование проводят в следующем порядке:

приготовление исходных концентрированных и рабочих растворов;

обработка исследуемых проб (выделение и очистка белковых структур);

ферментативная обработка белковых структур;

26.3. Постановка реакции проводится в следующем порядке:

26.3.1. отбирают образец ткани головного мозга (лобная, височная, затылочная, теменная части коры полушарий большого мозга, кора мозжечка, подкорковые ядра) массой 5 г;

26.3.2. образцы мозга измельчают и тщательно гомогенизируют в

гомогенизаторе Даунса (20 тракций);

26.3.3. готовят 10% мозговую суспензию на растворе 1 согласно приложению 15 с добавлением 1-2 капель изопропанола и центрифугируют при 22000 х g, 30 минут, 4°С;

26.3.4. отбирают надосадочную жидкость и центрифугируют при 215000 х g, 2 часа, 4°С;

26.3.5.осадок гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса (20 тракций) и разводят раствором 2 в соответствии с приложением 15;

26.3.6. суспензию центрифугируют при 215000 x g, 2,5 часа, 4°С;

26.3.7. полученный осадок растворяют в том же растворе (раствор 2), добавляют протеиназу К до конечной концентрации 20 мкг/мл и инкубируют в течение 2 часов при 37°С;

26.3.8. после ферментативного протеолиза материал помещают в эппендорф и центрифугируют при 6000 оборотов/минуту, 15 мин при 4°С;

26.3.9. осадок разводят буфером STE, рН 7,4 и повторно центрифугируют при 6000 оборотов/минуту, 15 минут при 4°С;

26.3.10. подобную операцию желательно проводить еще 1-2 раза, при этом потери белка составляют не более 5 процентов;

26.3.12. аликвоту полученной суспензии (5-10 мкл) наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваруглеродной подложкой, и инкубируют 1 минуту при комнатной температуре;

26.3.13. затем сеточки промывают дистиллированной водой (5 раз по 30 секунд);

26.3.14. для контрастирования сеточки помещают в 5% растворуранил ацетата на 15-20 минут, затем интенсивно промывают под проточной дистиллированной водой и высушивают на фильтровальной бумаге;

26.3.15. исследование образцов проводят на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 15000-60000;

26.3.16. учет результатов проводят после обработки, в исследуемых образцах центральной нервной системы сохраняются только аномальные PrP-структуры, в виде везикул, глобул, палочек и филаментов, состоящие из белка PrP27-32. Обычно PrP-структуры представлены относительно однородной по морфологии популяцией палочкообразных частичек диаметром от 10 до 25 нм и длиной от 100-200 до 500 нм. Выявление в исследуемых образцах аномальных

PrP-структур позволяет судить о наличии прионовой инфекции в ЦНС.

27. Диагностика прионовых инфекций методом ультратонких срезов осуществляется путем обнаружения дегенеративно-деструктивных изменений в тканях ЦНС методом электронной микроскопии.

27.1. Исследование проводят в следующем порядке:

27.3. Постановка реакции проводится в следующем порядке:

27.3.1. из ткани мозга (лобная, височная, затылочная, теменная, части коры полушарий большого мозга, кора мозжечка, подкорковые ядра и т.д.) вырезают кусочки объемом 0,5 куб.см и немедленно помещают в пробирку с 2,5% глутаровым альдегидом на 5-10 минут при 0°С;

27.3.2. извлеченные из глутарового альдегида кусочки мозга нарезают бритвенным лезвием на блоки объемом 1 куб.мм и снова помещают в 2,5% глутаровый альдегид на 2 часа при +4°С;

27.3.3. фиксированные кусочки мозга промывают в 3 сменах фосфатного буфера, охлажденного до +4°С, в течение 15 минут;

27.3.4. кусочки мозга дополнительно фиксируют в течение 1 часа в 1% ОsО4;

27.3.6. обезвоженные кусочки мозга помещают в смесь аралдитов, разведенную равным объемом ацетона, на 12 часов при комнатной температуре;

27.3.7. кусочки мозга переносят 3-4 часа в смесь аралдитов с добавлением 4% дибутилфтолата;

27.3.8. кусочки мозга помещают в капсулы, заливают свежей смесью аралдитов на 24 часа при +70°С для полимеризации;

27.3.9. блоки с образцами затачивают в виде пирамидки бритвенным лезвием под контролем бинокулярной лупы;

27.3.10. срезы готовят на ультрамикротоме и помещают на опорные электронно-микроскопические сеточки;

27.3.11. для контрастирования сеточки со срезами помещают в 5% раствор уранил ацетата на 15-20 минут, затем интенсивно промывают под проточной дистиллированной водой и высушивают на фильтровальной бумаге;

27.3.12. в чашку Петри вносят каплю раствора цитрата свинца и рядом с каплей помещают 5-7 гранул NаОН или КОН;

27.3.13. электронно-микроскопическую сеточку помещают срезом вниз в каплю раствора на 15-20 минут, промывают водой и высушивают;

27.3.14. исследование ультратонких срезов проводят на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ при увеличении 15000, 30000, 45000;

27.3.15. учет результатов при диагностике прионовой инфекции в ЦНС методом ультратонких срезов основывается на обнаружении дегенеративно-деструктивных изменений в нейронах головного, реже спинного, мозга, спонгиоза серого и белого вещества мозга, астроглиоза (гипертрофии астроцитов и их пролиферации) и амилоидоза (отложение амилоидных бляшек в стенках сосудов и паренхиме мозга). Обнаружение этих патогномических признаков заболевания

свидетельствует о развитии прионовой инфекции в ЦНС.

Глава 9. Выявление прионового белка PrP27-32 методом иммунного блотинга

28. Исследование проводят в следующем порядке:

приготовление исходных концентрированных и рабочих растворов;

обработка исследуемых проб;

приготовление пластины 12% ДСН-полиакриламидного геля;

перенос PrP с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную бумагу и приготовление полос шириной 0,5 см;

обработка нитроцеллюлозных полос исследуемыми образцами ЦНС;

28.2. Постановка реакции осуществляется следующим обоазом:

28.2.2. после окончания электрофореза гель осторожно снимается со стекла. С одного края обрезается полоска геля шириной 2 см для проверки качества разделения белков;

28.2.3. остальная часть геля замачивается на 30 минут в буфере для переноса, здесь же замачивается нитроцеллюлозный фильтр, крупнопористая фильтровальная бумага и поролоновые прокладки;

28.2.4. после истечения указанного периода времени готовится кассета для переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану. Для этого на поролоновую прокладку последовательно укладывают крупнопористый фильтр, нитроцеллюлозную бумагу, гель, фильтровальную бумагу и опять поролоновую прокладку. Вся кассета зажимается плотно между двумя

пористыми пластинами из оргстекла;

28.2.5. кассета опускается в камеру для переноса (нитроцеллюлозная мембрана со стороны (+), гель со стороны (-), которая заливается тотчас буфером для переноса;

28.2.6. электрофорез проводят в течение 2 часов при напряжении 160 В и силе тока 550 мА;

28.2.8. нитроцеллюлоза высушивается на воздухе и хранится между листами фильтровальной бумаги при +4°С до использования.

Выявление специфических полос в стрипах, соответствующих по электрофоретической подвижности контрольному образцу PrP, дает основание судить о наличии прионовой инфекции в ткани ЦНС. Отсутствие специфических PrP-полос в стрипах рассматривают как отрицательный результат.

Глава 10. Дифференциальный диагноз

29. Губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота необходимо дифференцировать от бешенства, листериоза, болезни Ауески, нервной формы инфекционного ринотрахеита, злокачественной катаральной горячки, а также отравлений фосфорорганическими, хлорорганическими, ртутьорганическими соединениями, фосфидом цинка, мышьяком, поваренной солью.

Основными отличительными признаками от губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота являются короткий латентный период (от 5 до 15 дней), острое или подострое течение, повышение температуры тела, отказ от корма и другие симптомы, присущие указанным заболеваниям, биопроба, данные вирусологических, бактериологических и токсикологических исследований.

Необходимо отметить, что прижизненная дифференциальная диагностика губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и бешенства, несмотря на всю ее значимость, имеет лишь ориентировочное значение. Основное практическое значение имеет посмертная диагностика, основанная на данных морфологического, серологического исследования и биопробы.

Для обнаружения телец Бабеша-Негри в гистосрезах, мазках и отпечатках мозга предложено множество способов окраски последних: по Михину, Муромцеву, Манну, Ленцу, Адуцкевичу.

Из серологических методов исследования наиболее специфичным при бешенстве является метод флюоресцирующих антител, позволяющий выявлять при наличии вируса в мозгу специфическое свечение (разной величины и формы гранулы яркого желто-зеленого цвета величиной от едва заметных образований до 15-20 микрон).

При отрицательных результатах, полученных морфологическими и серологическими методами, для окончательной постановки диагноза проводится биологическая проба, основанная на заражении исследуемым материалом лабораторных животных, главным образом белых мышей. С этой целью суспензией мозга 1:10 с добавлением антибиотиков заражают

в мозг 5-6 белых мышей весом 4-6 г в дозе 0,03 мл. Наблюдение за животными проводят в течение 14 дней. В случае падежа животных их мозг исследуют на наличие телец Бабеша-Негри. Если в течение 14 дней у зараженных животных не будут выявлены тельца Бабеша-Негри, то результат считается отрицательным.

При вскрытии у животных расчесы в области головы, спины, конечностей. На месте расчесов кожа гиперемирована, края раны отечные, подкожная клетчатка геморрагически инфильтрирована. При гистологическом исследовании в мозгу отмечается картина негнойного менингоэнцефалита. Он характеризуется образованием диффузной и очаговой пролиферации клеток глии, периваскулярной инфильтрацией, клетками ретикулоэндотериального типа, вакуолизацией и пикнозом

ганглиозных нервных клеток, нейрофагией, многорядовой пролиферацией клеток мозговых оболочек и боковых желудочков согласно приложениям 18 и 19.

Лабораторная диагностика болезни Ауески заключается в обнаружении и идентификации возбудителя болезни в патологическом материале (реакцией иммунофлуоресценции или иммуноферментногоанализа), выделении вируса на культуре клеток с последующей его типизацией, а также обнаружении противовирусных антител в сыворотке крови от больных и переболевших животных в реакции непрямой гемагглютинации, иммуноферментном анализе, реакции нейтрализации.

Возбудителем инфекции является Listeria monocytogenes.

Инкубационный период длится 1-4 недели. Течение болезни бывает острое, подострое и хроническое. Листериоз может проявляться несколькими формами: нервной, септической, смешанной, бессимптомной или выражаться в виде поражения половых органов и молочной железы. У крупного рогатого скота и овец отмечается преимущественное поражение

центральной нервной системы. Первые признаки характеризуются угнетением, снижением аппетита, в дальнейшем (1-7 дней) проявляются некоординированность движений, круговые движения, потеря равновесия, судороги, парезы отдельных групп мышц, потеря зрения, конъюнктивит, стоматит, оглумоподобное состояние, иногда приступы буйства. В начальной стадии болезни температура тела может быть несколько повышена или не превышать физиологической нормы, длительность

болезни 7-10 дней и в большинстве случаев животные погибают.

При вскрытии у крупного рогатого скота отмечают острую венозную гиперемию и отек легких, гистогнойный энцефалит (стволовая часть головного мозга и шейная часть спинного мозга) согласно приложениям 21 и 22.

Диагноз на листериоз устанавливают на основе эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и

лабораторных методов исследований.

Основанием для постановки диагноза является выделение возбудителя на питательных средах, его идентификация, биопроба на белых мышах и кроликах. Для серологической диагностики используют сыворотки крови от больных и переболевших животных. Наличие антител выявляют в реакции агглютинации, реакции связывания комплемента,

иммуноферментном анализе. Для ускорения диагностики используют люминесцентную микроскопию с использованием гипериммунной антилистериозной сыворотки, меченной флюорохромами.

33. Злокачественная катаральная горячка крупного рогатого скота— острая инфекционная болезнь крупного рогатого скота, характеризующаяся поражением слизистой оболочки головы, глаз и нервной системы.

Патологоанатомические измерения зависят от тяжести и продолжительности заболевания и характеризуются катарально-гнойным конъюнктивитом и кератитом, некрозом эпидермиса носового зеркальца и слизистой оболочки ротовой полости, гнойно-фибринозным ринитом, ларингитом, крупозно-геморрагическим или дифтеритическим колитом.

Методы диагностики основаны на выделении и идентификации вируса на культуре клеток и обнаружении специфических антител в реакции иммунодиффузии, реакции непрямой гемагглютинации или иммуноферментном анализе.

Нервная или менингоэнцефалитная форма инфекционного ринотрахеита возникает у животных после проникновения вируса через гематоэнцефалический барьер. Ее наблюдают редко и, как правило, у молодняка 2-6 месяцев. Она характеризуется расстройством двигательных функций и нарушением равновесия. Болезнь сопровождается

мышечным тремором, мычанием, скрежетом зубов, конвульсиями, слюнотечением.

Диагноз на инфекционный ринотрахеит ставят путем выделения и идентификации вирусов на культуре клеток, обнаружения противовирусных антител в сыворотках крови больных и переболевших животных в реакции нейтрализации, реакции непрямой гемагглютинации или иммуноферментном анализе.

35. Отравления мочевиной характеризуется сильным угнетением, потливостью, атаксией, слюнотечением, клоническими и тетаническими судорогами. Отравлению подвержены в основном взрослые животные.

Температура тела в норме. Заболевают единичные животные до 30-40%-го поражения стада.

36. Отравление ртутьорганическими соединениями характеризуется резким угнетением, сильной саливацией, поносом, полиурией, угнетением сердечной деятельности, атаксией, парезами, параличами.

Температура тела в норме. Заболевают единичные животные до массовых случаев поражения стада.

Основанием для постановки диагноза являются лабораторные исследования содержимого рубца на наличие в нем соединений ртути.

37. Отравление хлорорганическими соединениями характеризуется резким угнетением или возбуждением, сильной саливацией, поносом, полиурией, судорогами, сердечной недостаточностью, парезами, параличами. Температура тела в норме. Заболевают единичные животные до массовых случаев поражения стада.

Основанием для постановки диагноза являются химико-токсикологические лабораторные исследования содержимого рубца

на наличие в нем хлорорганических соединений.

38. Отравление фосфорорганическими соединениями характеризуется расстройством нервной системы, повышенной возбудимостью, затем угасанием рефлексов, атаксией, сильной саливацией, поносом, судорогами, сердечной недостаточностью. Температура тела в норме. Заболевают единичные животные до массовых случаев поражения стада.

Основанием для постановки диагноза являются химико-токсикологические лабораторные исследования содержимого рубца на наличие в нем хлорорганических соединений.

39. Наряду с поражением крупного рогатого скота губкообразной энцефалопатией аналогичные изменения отмечаются и у овец при скрепи, аденоматозе, висна.

39.1. При аденоматозе овец наряду с головным мозгом поражаются и легкие. При этом отмечают метаплазию альвеолярного эпителия в виде онкоподобных аденом на фоне расплавления межальвеолярных перегородок и образования эмфизематозных полостей согласно приложению 23.

39.2. При заболевании овец висна отмечают периваскулярный инфильтрат крупноклеточных элементов в стволовой части продолговатого мозга согласно приложению 24.

39.4. При меди овец отмечается пролиферация круглоклеточных элементов в интерстициальной ткани легких, перибронхим, расплавление межальвеолярных перегородок и образование эмфиземоподобных полостей согласно приложению 29.

39.5. При проведении гистологических исследований в нормальных участках головного мозга преобладают волокна нейроглии, заметны нейроны согласно приложениям 11 и 12. При микроскопии гистосрезов из мозжечка здоровых животных при микроскопии видны грушевидные клетки Пуркинье, зернистый слой с мелкими нейронами, молекулярный слой (немиелизированные волокна), нейроны согласно приложению 13.

Глава 11. Установление окончательного диагноза на губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота

40. Подтвержденным на губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота диагноз следует считать только на основании комплексного анализа эпизоотологических, клинико-анатомических и патогистологических исследований. При этом следует сравнивать гистопрепараты отделов головного мозга, полученные от заведомо здоровых животных и от животных с различными поражениями центральной нервной системы, согласно приложениям 8-13 и 18-29.

41. Подтверждением диагноза на губкообразную энцефалопатию крупного рогатого скота является заключение региональной референтной лаборатории Международного эпизоотического бюро, расположенной во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (г.Владимир, Российская Федерация), путем исследования иммуногистохимическим методом наличия патологических PrP-белков в обычных фиксированных в формалине срезах участков головного мозга крупного рогатого скота с наиболее характерными патогномоничными признаками, характерными для этого заболевания, выявленными после патогистологических исследований.

Глава 12. Меры безопасности при работе с патологическим материалом

при проведении диагностических исследований

42. При работе с патологическим материалом, содержащим возбудитель губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота, необходимо учитывать высокую устойчивость возбудителя к физико-химическим факторам и в этой связи строго соблюдать правила техники безопасности.

43. Все работы, связанные с распиловкой головы, извлечением головного мозга, отбором проб для патогистологических, бактериологических и вирусологических исследований, следует проводить в соответствии с требованиями санитарных правил «Безопасность работы с микроорганизмами I и II групп патогенности», утвержденных постановлением Главного санитарного врача

44. Специалист, который проводит исследования, должен иметь халат, прорезиненный (лучше хлорвиниловый) фартук с нарукавниками, анатомические перчатки, резиновые сапоги, водонепроницаемый капюшон, защитную маску из оргстекла для исключения попадания на лицо или глаза брызг крови, осколков костной ткани и интрацеребральной жидкости.

45. По окончании работ необходимо обработать настойкой йода или бриллиантовой зелени ногти и различные царапины или травмы рук.

Также по окончании работ инструменты, которыми проводили отделение головы, укладываются в стерилизатор с 2-процентным раствором гипохлорида натрия не менее чем на 1 час (инструменты должны быть погружены в раствор полностью). Сапоги, фартук, капюшон, маску и перчатки также обрабатывают 2-процентным раствором гипохлорида натрия. Халаты обрабатывают автоклавированием при 132°С в течение 60 минут. Горючие отходы сжигают.

46. Труп животного, а также и голову (после отбора мозга) рекомендуется утилизировать в яме Беккари или в яме глубиной не менее 2 метров, предварительно обильно засыпав хлорной известью, или сжигать. Неиспользованные участки головного мозга целесообразно сжечь в муфельной печи, а при ее отсутствии утилизировать, как труп животного.

Аппаратура, материалы и инструменты, используемые для гистологической обработки и окраски тканей

1. Автомат универсальный (типа АТ-4, АТ-5) для гистологическойобработки и окраски тканей

2. Термостат суховоздушный (на 37°С)

3. Термостат для парафиновой заливки ТВЗ-25 (на 58-60°С)

4. Микротом санный (мс) или для парафиновых срезов (МПС-2)

5. Станок для заточки микротомных ножей

6. Станок для правки микротомных ножей

7. Микротомные ножи (для парафиновых или целлоидиновых срезов)

8. Формалин (коммерческий), параформ

10. Медь сернокислая (5-водная или безводная)

12. Уксусная кислота (ледяная)

13. Гематоксилин (или гематеин)

14. Эозин калия или натрия

15. Соляная кислота

16. Ксилол (пара-, орто-, мета-)

17. Фенол (карболовая кислота)

18. Иглы препаровальные гистологические (стоматологический зонд)

20. Блоки деревянные (или текстолитовые)

21. Плитка электрическая (газовая горелка)

23. Часы песочные на 1, 2, 3, 5, 10 минут

24. Карандаш по стеклу (тушь черная, чернила по стеклу)

25. Бальзам канадский (пихтовый)

26. Предметные и покровные стекла

27. Фильтровальная бумага (фильтры)

Приготовление различных концентраций спиртов

Источник

• ← какую цель ставит перед собой технология развивающего обучения
• какую часть долга на практике получают обратно кредиторы в год при банкротстве контрагента →