методы консервации крови общая хирургия

Консервирование крови

Консервирование крови – это создание условий для длительного хранения крови вне организма с сохранением биологических и функциональных свойств форменных элементов плазмы.

Существуют два основных метода хранения крови: 1.) в жидком состоянии при температуре выше или ниже 0 градусов. 2.) в замороженном, твердом состоянии при температуре ниже 0 градусов (вплоть до ультранизких, обеспечивающих многолетнее хранение клеток крови).

Идея сохранения крови длительное время для последующего переливания принадлежит русскому ученому В. Сутугину (1865), который предложил переливание дефибринированной крови. Однако, она была претворена в жизнь лишь после того, как появилось научное обоснование предотвращения свертывания крови при помощи антикоагулянтов. В 1914 году Dagote и Lewisohn независимо друг от друга открыли способность цитрата блокировать свертывание крови. В 1961 году Mclean обнаружил гепарин.

Для консервирования крови необходимы следующие основные условия: первое – лишение ее способности свертываться, т. е. стабилизация; второе – поддержание физиологической полноценности эритроцитов в процессе хранения.

Стабилизация крови в несвернутом состоянии достигается связыванием или разрушением одного из компонентов системы свертывания крови. Наиболее широко в практике применяются стабилизаторы, устраняющие ионы кальция. Связывание последнего подавляет первый этап процесса свертывания крови – образование тромбина. Чаще применяют лимонную кислоту и лимоннокислый натрий (цитрат натрия).

Эти стабилизаторы не безразличны для организма и введение их в значительном количестве при массивных переливаниях консервированной крови может иметь нежелательные последствия (“цитратный шок”). Поэтому в ряде случаев, когда необходимо переливание значительных количеств крови, применяют безцитратную кровь. Стабилизация такой крови достигается благодаря применению гепарина или путем удаления из крови ионов кальция. Гепаринизированная кровь используется главным образом, при искусственном кровообращении для заполнения аппарата “сердца-легкие”. Максимальный срок хранения гепаринизированной крови 1 сутки.

Ионы кальция удаляются из крови при обработке катионнообменной смолой, которая, поглощая ионы кальция, отдает в кровь ионы натрия. Декальцинация крови предотвращает ее свертывание. Добавление электролитов, глюкозы и сахарозы позволяет хранить кровь в течение 20-25 дней.

Помимо стабилизаторов, предупреждающих свертывание крови, в состав консервирующих растворов вводят вещества, проникающие в эритроцит и участвующие в его метаболизме (глюкоза, неорганический фосфат и др.).

В числе консервирующих растворов используют также вещества, не проникающие в клетки-дисахариды, сахарозу, лактозу и многоатомные спирты (маннит, сорбит). Эти вещества не принимают участия в метаболизме клетки. Их действие сводится к защите структуры эритроцита, сохранению осмотического давления, что уменьшает набухание клетки и ее гемолиз.

Наиболее часто для консервирования крови применяют глюкозо-цитратные растворы (ЦОЛИПК № 7, ЦОЛИПК № 8, ЦОЛИПК № 12 А, Л-6, Л-15, Л-14 и др.). Разведенная этими растворами кровь в соотношении 1:4 может храниться 21 день.

В процессе хранения в консервированной крови происходит ряд биохимических и морфологических изменений, в результате которых физиологическая ее полноценность к концу срока хранения снижается, в частности уменьшается кислородотранспортная функция эритроцитов. Вследствие этого, необходимо стремиться переливать кровь со сроком хранения 5-7 дней. Свежей считается кровь, консервированная не более чем 3 дня перед использованием. Она обладает наиболее оптимальным эффектом. Кровь со сроком хранения свыше 3 дней считается “старой”.

Для консервирования крови применяют преимущественно флаконы вместимостью: 100,250,300,500 мл. В настоящее время широкое распространение получили полимерные контейнеры типа Гемакон 500,Гемакон 500/300.

Они изготовлены из небьющегося материала, прозрачны, упрощают заготовку крови и ее компонентов, легки и удобны при транспортировке. В силу того, что их стенки гладкие и нейтральные, клетки крови сохраняются дольше.

Консервирование крови путем замораживания принципиально отличается от вышеописанного тем, что при этом способе достигается не поддержанием обменных процессов, а наоборот, их полное прекращение до стадии анабиоза. Существует два способа замораживания: 1.) очень быстрое охлаждение (250 мл крови в течение 2 минут до –196˚С) и хранение в жидком азоте (при температуре –196˚С) 2.) медленное охлаждение, при котором замораживание длится несколько часов при умеренно низких температурах (от –25˚С до –100˚С) в рефрижераторах. Для сохранения клеток крови при том и другом методах применяются ограждающие растворы, криопротекторы. Замораживают раздельно клетки крови и плазмы.

В целях защиты клеток, тканей и органов от разрушительного действия низких температур применяют две группы криопротекторов – эндоцеллюлярные (глицерин, диметилсульфоксид, глюкоза) и экстрацеллюлярные (лактоза, сахароза, маннит, полиэтиленоксид). Механизм защитного действия этих веществ основан на их способности образовывать прочные связи с водой, что препятствует образованию кристаллов воды, а, следовательно, дегидратации клеток и их механическому повреждению.

Самым надежным криопротектором считают глицерин, хотя процесс отмывания от него размороженных клеток сложен и длителен.

Число восстановленных клеток после оттаивания достигает 92-97 % при хранении эритроцитов в жидком азоте до 5 лет. Вообще замороженные эритроциты могут храниться до 10 лет. Замороженные лейкоциты сохраняют 85-96 % жизнеспособных клеток, а тромбоциты – до 75 %. Их биологическая полноценность доказана приживлением свыше 90 % размороженных эритроцитов и нормальным сроком их циркуляции в организме.

Перед переливанием замороженные эритроциты быстро подогреваются до температуры +38˚С отмываются от ограждающих растворов, после чего физиологическая ценность полностью восстанавливается и они переливаются по обычным правилам.

Кровь, заготовленную методом криоконсервирования, хранят в специальных холодильниках – рефрижераторах. Сроки хранения до 10 лет.

Кроме описанных методов, для консервирования препаратов крови (плазма, тромбин) применяется метод лиофильной сушки, который производится с помощью специальной аппаратуры. Сухая плазма и другие препараты хранятся при комнатной температуре. Перед применением они разводятся стерильной дистиллированной водой до первоначального объема и применяются по правилам, изложенным в соответствующих инструкциях.

Источник

КОНСЕРВИРОВАНИЕ КРОВИ

КОНСЕРВИРОВАНИЕ КРОВИ (лат. conservare хранить, сохранять) — методы хранения крови вне организма в состоянии ее биологической и функциональной полноценности. При консервировании кровь не утрачивает стерильности, жидкостных свойств в течение определенного срока, что позволяет заготавливать и применять ее для переливания с леч. целью.

Русский ученый В. В. Сутугин впервые в 1865 г. высказал идею К. к. с целью последующего использования ее при военной травме. В 1867 г.

B. Раутенберг предложил предотвращать свертывание крови с помощью добавления углекислого натрия. Планомерное изучение проблемы К. к. в СССР началось в 1926 г. в Москве, в первом в мире Научно-исследовательском ин-те гематологии и переливания крови. Большой вклад в разработку этой проблемы внесли Д. Н. Беленький, C. И. Спасокукоцкий, А. А. Багдасаров, С. Д. Балаховский, А. Н. Филатов, С. Е. Северин, Ф. Р. Виноград-Финкель, П. М. Максимов и многие другие.

В 30-х гг. для К. к. начали применять жидкость ЦИПК — 5% р-р цитрата для малого разведения (1:9) и глюкозоцитратный консервант ЦИПК № 1.

К 1940 г. в СССР были разрешены основные задачи проблемы К. к. и установлена леч. эффективность такой крови, что позволило широко внедрить в практику ее массовую заготовку. В период 1941 — 1945 гг. были разработаны способы предотвращения бактериального загрязнения крови при ее массовой заготовке и хранении, а также новые консервирующие среды с лимоннокислым цитратом натрия и антисептиками. Это значительно повысило качество К. к. и снизило опасность гемотрансфузионных осложнений.

В последующие годы продолжались теоретические и практические изыскания, направленные на удлинение сроков хранения крови при температурах выше и ниже 0° — в жидком и замороженном состоянии.

Консервирование крови при температурах выше 0°

Наибольшее распространение как стабилизаторы получили лимонная к-та и лимоннокислый цитрат натрия. Механизм их действия состоит в связывании ионов кальция, что предотвращает свертывание крови.

Динатриевая соль этилендиаминтетраацетата — ЭДТАNa₂ — также связывает ионы кальция. Однако одновременно она вызывает связывание ионов калия и магния и ранний гемолиз консервированной крови, что ограничило ее применение. Гепарин (50—60 мг на 1 л крови) используется для стабилизации крови гл. обр. в аппаратах искусственного кровообращения. Недостатком его является ограничение сроков стабилизации (до 24 час.) и образование сгустков за счет инактивации гепарина, в связи с чем он применяется лишь для кратковременного (несколько часов) К. к.

Стабилизация крови может быть достигнута и без добавления хим. веществ — путем пропускания крови через колонку с катионообменными смолами. По этому принципу в Белорусском НИИ переливания крови Е. Д. Бугловым в 1969 г. разработан препарат M-1-фосфат целлюлозы.

Для К. к., кроме стабилизации, имеет значение сохранение морфол, целостности эритроцитов и их функц, полноценности. Для этого требуется постоянный приток основного субстрата питания этих клеток — глюкозы, а также средств, обеспечиващих ее утилизацию,— ферментов и коферментов.

Установлена прямая связь кислородно-транспортной функции эритроцитов с содержанием 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ), его важная роль в регуляции сродства гемоглобина к кислороду и в процессе отдачи кислорода тканям: при низкой концентрации в эритроцитах 2,3-ДФГ сродство гемоглобина к кислороду повышено, при этом диссоциация оксигемоглобина и передача кислорода тканям затруднены; при высокой концентрации 2.3-ДФГ связи гемоглобина с кислородом ослаблены, оксигемоглобин диссоциирует быстрее и ткани легко извлекают кислород из его комплекса с гемоглобином. Известно, что АТФ, кроме участия в формировании 2,3-ДФГ, также может быть связана с гемоглобином и влиять на процесс отдачи кислорода тканям; поэтому предполагается корреляция кислородно-транспортной функции эритроцитов с содержанием 2.3-ДФГ и АТФ. Т. о., наряду со стабилизацией, основное требование к гемоконсервантам — пополнять недостаток АТФ и 2,3-ДФГ. Введение в цитратный р-р для К. к. глюкозы дало возможность продления синтеза АТФ и покрытия потребности эритроцитов в энергии. Кроме того, важным моментом явилось доведение pH консервирующих р-ров до 4,5—5,1 (при этом эритроциты медленнее потребляют глюкозу), что отдаляет наступление гемолиза и повышает посттрансфузионную выживаемость эритроцитов.

Кислые глюкозоцитратные р-ры начиная с 1947 г. получили признание во многих странах. Они позволяют сохранять консервированную кровь при t 4—8 до 21 дня с посттрансфузионной выживаемостью 70% перелитых эритроцитов, что является международным стандартом. В СССР применяется р-р ЦОЛИПК-76, ЛИПК-Л-6, в США и др. странах — р-р ACD.

Состав консервирующего р-р а ЦОЛИПК-76: лимоннокислый цитрат натрия — 2 г, глюкоза — 3 г, левомицетин — 0,015 г, бидистиллированная вода до 100 мл. Срок хранения — до 2 лет.

Состав гемоконсерванта ЛИПК-Л-6: лимоннокислый цитрат натрия — 2,5 г, глюкоза — 3 г, натрия сульфацил — 0,5 г, трипафлавин нейтральный — 0,025 г, бидистиллированная вода до 100 мл. Срок хранения — до 7 дней.

Кислые глюкозоцитратные р-ры стали основой для создания новых гемоконсервантов, напр, цитроглюкофосфата, содержащего 1 г лимонной к-ты, 0,75 г тринатрийфосфата, 3 г глюкозы, до 100 мл б о дистиллированной воды, нормального р-ра едкого натра до pH 5,7 (20 мл р-ра на 80 мл крови), позволяющего удлинить сохранность функ. полноценности эритроцитов. За рубежом применяется цитратно-фосфатный р-р с декстрозой — СРВ.

Включение в гемоконсерванты метаболитов углеводно-фосфорного обмена (аденин, инозин, пируват и др.) открыло новую перспективу в К. к.— возможность восстановления («омоложения») консервированных эритроцитов после предельно допустимых сроков (21 день) хранения. Инкубация длительно хранившихся консервированных эритроцитов с метаболитами углеводно-фосфорного обмена приводит к восстановлению утраченной в процессе хранения их функц, полноценности (содержания 2,3-ДФГ, АТФ, Р50 и других показателей). Последующее замораживание восстановленных эритроцитов в жидком азоте позволяет сохранять «омоложенные» клетки длительное время.

Разработаны методы получения и консервирования компонентов крови: эритроцитной, тромбоцитной, лейкоцитной массы и плазмы. Консервирование клеток крови имеет большое значение, особенно в связи с возрастающим использованием в леч. практике трансфузий отдельных компонентов вместо цельной крови.

Эритроцитная масса (см.) — наиболее распространенная Трансфузионная среда. Получают ее путем асептического удаления плазмы после отстаивания или центрифугирования консервированной крови; в последующем возможно хранение конц. эритроцитной массы (гематокрит до 70%)- В леч. практике применяется также отмытая эритроцитная масса (подвергнутая повторному асептическому отмыванию физиол. р-ром), особенно у реактивных больных (сенсибилизированных, аллергизированных и др.).

Для применения в клин, практике лейкоцитной и тромбоцитной масс разработаны методы их получения с использованием центрифугирования в пластикатной аппаратуре и коллоидных осадите лей. Лейкоцитная масса (см. Лейкоконцентрат) сохраняется до 24 час.

Тромбоцитная масса (см.) сохраняется в собственной плазме при t° 4° в течение 6—8 час., а при t° 22° в пластикатных мешках — 72 часа.

Выделение и хранение лейкоцитной и тромбоцитной масс, кроме пластикатной аппаратуры, осуществляют с помощью специальных фракционаторов для автоматического асептического разделения крови на компоненты и получения в больших количествах этих клеток от одного донора методом цитафереза. (см. Плазмаферез).

Массовую заготовку консервированной крови и ее компонентов проводят учреждения службы крови (станции и отделения переливания крови) по единым методическим правилам. Кровь консервируется гл. обр. на стерильных гемоконсервантах 76 и цитроглюкофосфате, изготовляемых на заводах. Взятие крови от доноров в стеклянные флаконы или пластикатные мешки с гемоконсервантом производится в стационарных операционных станций и отделений переливания крови или по месту работы доноров, куда направляются специальные бригады, оснащенные всем необходимым для заготовки крови. Стерильность К. к. обеспечивается соблюдением строгих мер асептики при ее заготовке от доноров, использованием простерилизованных гемоконсервантов (в герметически укупоренных флаконах или пластикатных мешках) и замкнутых стерильных систем для взятия крови (рис. 1). Стерильность и качество консервированной крови строго контролируют путем выборочных бактериол, посевов, производимых на станциях и в отделениях переливания крови, а также макроскопической оценкой в леч. учреждениях перед выдачей для трансфузии.

Консервирование крови при температурах ниже 0°

Долгосрочное хранение клеток крови и плазмы возможно лишь при отрицательных температурах. При этом клетки сохраняются в анабиотическом состоянии — при подавлении метаболизма, но сохранении активности ферментных систем и жизнеспособности клеток.

Замораживание и хранение плазмы производят при t° —30°. Решению проблемы замораживания эритроцитов помогло установление факта, что ультрабыстрое охлаждение крови (100° в секунду) может происходить почти без кристаллического затвердевания (в тонком слое удавалось заморозить и сохранить малые объемы эритроцитов), и открытие криозащитного свойства глицерина, позволившего при смешении с эритроцитами сохранять их в замороженном состоянии. А. Д. Беляков с соавт. в 1956 г. и Ф. Р. Виноград-Финкель с соавт, в 1958 г. разработали метод сохранения клеточных элементов крови в переохлажденном состоянии при температурах ниже 0° (от —8 до —16°) без кристаллообразования.

В практике применяют два метода криоконсервирования эритроцитов: ультрабыстрое замораживание в жидком азоте (—196°) с малыми (15%) концентрациями глицерина или медленное замораживание с большой (30—50%) концентрацией глицерина при умеренных температурах (—40, —80°) в воздушной камере электрорефрижераторов. Эти методы позволяют длительно (годами) сохранять неповрежденными 85—95% эритроцитов.

Методика ультрабыстрого замораживания эритроцитной массы состоит в том, что из цельной донорской крови после центрифугирования эритроциты выделяют с соблюдением строгих условий асептики и смешивают их со стерильным ограждающим р-ром, содержащим глицерин. Смесь переводят в алюминиевый гофрированный контейнер или специальный пластикатный мешок и подвергают в течение 2 мин. замораживанию путем погружения в ванну с жидким азотом, после чего переносят в специальный бункер или камеру также с жидким азотом для последующего длительного хранения. Для использования замороженных эритроцитов контейнеры или мешки вынимают из жидкоазотного хранилища, подвергают оттаиванию путем помещения на 25 сек. в ванну с водой (t° 45°). После оттаивания производят отмывание эритроцитов от глицерина маннитно-солевыми, глюкозоманнитными, солевыми и другими р-рами с последовательно снижающейся гиперосмией до изоосмии. Для отмывания эритроцитов используют метод последовательного центрифугирования и сливания надстоя или автоматические фракционаторы различного типа для асептического отмывания размороженных эритроцитов в замкнутой системе. Отмытые эритроциты заливают равным объемом изотонических р-ров (сахарозоглюкозофосфатный, солевой и др.), после чего они пригодны для переливания в течение 24 час.

Методика медленного замораживания при умеренных температурах имеет свои преимущества — не требуется жидкоазотного оборудования, т. к. используются электрорефрижераторы. В качестве эндоцеллюлярного криофилактика широко применяют глицерин в большой концентрации (40%), хотя это и усложняет способы его отмывания после размораживания эритроцитов.

Для криоконсервирования лейкоцитов и тромбоцитов подобраны ограждающие р-ры, содержащие криофилактики эндоцеллюлярного (глицерин, диметилсульфоксид, диметилацетамид) или экзоцеллюлярного действия (поливинилпирролидон) в сочетании с углеводными р-рами (сахароза, глюкоза, аскорбиновая к-та). Замораживание клеток производят в специально сконструированных аппаратах, позволяющих охлаждать их по заданной программе. После программного замораживания и оттаивания лейкоцитов можно получать от 75 до 92% восстановленных клеток.

Существует метод разделения лейкоцитной массы на лимфоциты и гранулоциты. Размороженные лимфоциты предназначаются для типирования и переливания больным с угнетенной иммунол, активностью; гранулоциты можно использовать при лечении больных с септицемиями, агранулоцитозом и др.

Замораживание, хранение, оттаивание и отмывание эритроцитов и других клеток крови производятся в специально организованных отделениях (банках) долгосрочного хранения замороженной крови при учреждениях службы крови (рис. 2).

Клин, опыт подтверждает эффективность трансфузий взвеси размороженных эритроцитов при лечении острой кровопотери, анемий различной этиологии, при операциях на открытом сердце и при использовании аппарата «искусственная почка». Преимущества трансфузий размороженных отмытых эритроцитов заключаются в их лучшей переносимости (без посттрансфузионных реакций) больными, сенсибилизированными или аллергизированными предыдущими переливаниями крови или медикаментозными средствами. Они не содержат иммуноагрессивных клеточных (лейкоциты и тромбоциты) и белковых компонентов плазмы, являющихся основной причиной реакций при повторных трансфузиях (см. Переливание крови).

Метод криоконсервирования крови, помимо обеспечения многолетнего хранения, создания запасов крови редких групп, снижает риск заражения вирусным гепатитом В. Он также дает возможность широкого применения аутотрансфузий путем предварительного накопления крови от данного больного и длительного ее хранения в замороженном состоянии до момента операции или необходимости трансфузий (см. Аутогемотрансфузия).

Посмертная кровь

Идея заготовки и применения посмертной (трупной, постагональной, фибринолизной) крови была высказана и экспериментально обоснована B. Н. Шамовым в 1929 г., который доказал, что кровь трупов животных в первые 6—8 час. после смерти сохраняет свою полноценность, не имеет токсических свойств и оказывает леч. эффект при переливании обескровленным собакам. В 1930 г.

C. С. Юдин впервые с успехом произвел переливание посмертной крови больному с острой кровопотерей. Дальнейшие многолетние исследования ряда авторов послужили основанием для заключения о сохранности функц, полноценности посмертной крови, ее нетоксичности и выраженной леч. эффективности для человека.

Особым качеством посмертной крови является ее способность после заготовки свертываться, а затем «развертываться», т. е. сгусток вновь переходит в жидкое состояние. Это свойство, названное фибринолизом (см.), — сложный биол, процесс, происходящий в системе свертывания крови после смерти. Оно используется с диагностической целью: фибринолиз характерен только для крови скоропостижно скончавшихся людей и не наблюдается в случаях смерти после длительной агонии. Фибринолиз позволяет заготавливать и хранить кровь без добавления стабилизирующих средств. В СССР в Московском городском НИИ скорой помощи им. Н.Б. Склифосовского и Ленинградском городском НИИ скорой помощи им. проф. Ю. Ю. Джанелидзе накоплен большой опыт заготовки и применения посмертной крови. В ряде городов организованы специальные отделения для заготовки от трупов органов и тканей, в т. ч. крови. Существуют определенные правила взятия крови (в первые 6—8 час. после смерти) от внезапно умерших в результате острой сердечно-сосудистой недостаточности, спазма или склероза коронарных сосудов, инфаркта миокарда, гипертонической болезни, кровоизлияния в мозг, электротравмы, закрытой травмы черепа, спинного мозга, шейного отдела позвоночника, асфиксии от сдавления. Установлена возможность удлинения сроков хранения посмертной крови путем добавления специальных консервирующих р-ров (сахарозоглюкозофосфатного).

Использование посмертной крови, хранившейся при температуре 4—6°, разрешается после получения результатов лабораторного исследования крови и суд.-мед. вскрытия трупа. По данным К. С. Симоняна с соавт. (1975), ок. 24% заготовленной крови бракуется: 7% по бактериальному загрязнению, 13% по серол, показателям и примерно 4% на основании противопоказаний по данным патологоанатомического исследования.

Переливание посмертной крови не получило широкого распространения в леч. практике гл. обр. в связи с хорошей организацией донорства и службы крови, обеспечивающей леч. учреждения консервированной кровью.

Источник

Глава 3

ХРАНЕНИЕ КРОВИ

3.1. Консервирование крови

3.1.1. Основные понятия

Консервирование крови – это комплекс воздействий на нее, имеющих своей целью создание условий для длительного хранения крови вне организма в стерильном состоянии с максимальным сохранением ее биологических свойств (как форменных элементов, так и жидкой части крови).

Для консервирования крови используются два метода:

консервирование при положительных температурах;

консервирование при отрицательных температурах.

Хранение крови при положительных температурах обычно происходит в бытовых комнатных холодильниках.

Они обеспечивают поддержание температурного режима в пределах от +2 до +4°С. При таких температурах можно хранить консервированную цельную кровь, эритроцитную массу, нативную плазму.

Различные компоненты крови имеют разные сроки хранения. Так, например, эритроциты могут сохранять свои свойства в течение нескольких недель, а лейкоциты и тромбоциты – только несколько дней. Это объясняется тем, что лейкоциты и тромбоциты – ядерные клетки с более сложными функциями, а при длительном хранении в первую очередь изменения затрагивают ядро клетки. Срок хранения нативной плазмы ограничен тремя днями. Это обусловлено тем, что за это время инактивируется большая часть биологически активных веществ, входящих в ее состав.

Для того чтобы избежать таких нежелательных последствий при длительном хранении крови, используется ее консервирование при отрицательных температурах. Это позволяет увеличить срок хранения крови за счет того, что обменные процессы в клетках в значительной степени подавляются, а это препятствует раннему их «старению».

Для криоконсервирования используются следующие температурные режимы:

умеренно низкие температуры (–40. –60°С),

ультранизкие температуры (–196°С).

Величиной температуры определяются сроки, в течение которых эритроциты смогут сохранить свои свойства. При умеренно низких температурах они могут храниться несколько месяцев, а при ультранизких – 10 и более лет.

Принимая во внимание то, что ядерные клетки «стареют» быстрее, чем эритроциты, для консервирования лейкоцитов и тромбоцитов желательно использовать ультранизкие температуры, так как при умеренно низких температурах срок хранения уменьшается до нескольких недель.

3.1.2. Консервирующие растворы

Для увеличения продолжительности сроков хранения крови вне организма используют специальные растворы – гемоконсерванты.

В качестве обязательного компонента во все консервирующие растворы входят особые химические вещества – стабилизаторы. Широкое распространение в практической деятельности получили такие стабилизаторы как лимонная кислота и цитрат натрия. Они связывают ионы кальция, что способствует подавлению одного из этапов процесса гемостаза – образования тромбина.

Важным свойством цитрата натрия является то, что через 20–30 мин после трансфузии крови, стабилизированной с его помощью, он почти полностью (не менее 90%) выводится из организма.

Необходимо помнить о том, что при острой кровопотере или других состояниях (гипотермия) в результате введения стабилизированной цитратом натрия крови может возникнуть дефицит ионов кальция (см. гл. 9), поэтому после гемотрансфузии объемом в 500 мл надо внутривенно ввести 10 мл 10% раствора хлорида или глюконата кальция. Этого бывает вполне достаточно для восполнения возникающего дефицита кальция.

К другой разновидности стабилизаторов относится гепарин. Он препятствует свертыванию крови, непосредственно связывая и инактивируя тромбин. Существенным недостатком гепарина при использовании его в качестве стабилизатора является то, что он не позволяет длительно сохранять консервированную с его помощью кровь, потому что по мере увеличения срока хранения происходит инактивация гепарина. В результате этого уже через сутки образуются мелкие, а через двое суток и крупные сгустки крови.

Гепарин как консервант кроме самого гепарина (50 мг) содержит глюкозу (5 г), изотонический раствор хлорида натрия (до 100 мл). У этой смеси рН=7,3. Соотношение «раствор – кровь» при консервации должна быть 1:9. Такой метод стабилизации крови используется в случае необходимости ее срочного применения. Так, гепаринизированная кровь получила применение при проведении операций с использованием аппаратов искусственного кровообращения – ею заполняют аппарат.

При заготовке крови обычно используются следующие гемоконсерванты:

Глюкозоцитратный раствор глюгицир – это гемоконсервант ЦОЛИПК-7б без левомицетина. В его состав входят:

У глюгицира рН=5,0. Он стерилизуется в автоклаве при температуре +120°С в течение 30 мин. Срок хранения 2 года. Для достижения устойчивой стабилизации крови соотношение ее объема и объема консерванта должно составлять 4:1.

Гемоконсервант Л-6 – кислый глюкозоцитратный раствор с сульфацилом натрия, в состав которого входят:

Гемоконсервант Л-6 имеет рН, равный 4,9. Этот раствор стерилизуется в автоклаве при температуре +120°С в течение 30 мин. Срок хранения 7 дней.

Раствор цитроглюкозофосфата, в состав которого входят:

рН данного раствора равен 5,7. Цитроглюкозофосфат стерилизуется в автоклаве при температуре +106°С в течение 45 мин. Если раствор изготовлен в заводских условиях, то срок его хранения может быть до 2 лет.

Заготовка крови с помощью раствора цитроглюкозофосфата предпочтительнее, так как повышение рН раствора до 5,7 обеспечивает более высокую концентрацию ионов водорода консервированной крови во время ее хранения (рН консервированной крови повышается до 7,2). Кроме того он содержит меньше анионов лимонной кислоты, что уменьшает опасность развития цитратной интоксикации (см. гл.9). Также в растворе цитроглюкозофосфата медленнее разрушаются фосфатные соединения. За счет этого сохраняется на достаточно высоком уровне кислородно-транспортная функция эритроцитов.

Кровь, заготовленную с помощью вышеперечисленных гемоконсервантов, можно переливать в течение 21 дня хранения. Однако целесообразнее, особенно у тяжелобольных со значительными нарушениями гомеостаза, использовать ее в первые 7 дней после заготовки (приживаемость перелитых эритроцитов после непродолжительных сроков хранения значительно выше).

При заготовке крови для экстракорпорального кровообращения в последние годы с успехом применяют гемоконсервант ЦОЛИПК-12а следующего состава:

Кровь заготовленная с помощью этого раствора, обладает наиболее оптимальными параметрами для заполнения аппарата искусственного кровообращения. Она имеет преимущества перед кровью, консервированной с помощью других растворов, вследствие меньшего количества анионов лимонной кислоты, а для нейтрализации их избытка требуется незначительное количество хлорида кальция, в результате чего устраняется возможность развития гиперкальциемии у реципиента. Кровь, стабилизированную консервантом ЦОЛИПК-12а, имеет самый высокий уровень рН, поэтому она более длительно сохраняет кислородно-транспортную функцию. По основным свойствам в первые 4–5 дней хранения эта кровь почти не отличается от свежезаготовленной. За счет этого такая кровь может быть использована в эти дни для экстракорпорального кровообращения.

В процессе хранения консервированная кровь претерпевает многочисленные изменения. В первую очередь изменения затрагивают клеточные элементы крови. Так, постепенно меняется форма эритроцитов – из дискоидной в шаровидную, а в дальнейшем в сферическую. Но изменения не ограничиваются только внешней стороной – одновременно с этим происходит изменение биохимических и физико-химических свойств эритроцитов.

Полноценность консервированной крови определяется уровнем макроэргических фосфатов в ней. Поэтому применяются такие гемоконсерванты, которые способны поддерживать уровни АТФ и 2,3-ДФГ, так как они отвечают за поддержание жизнеспособности эритроцитов и сохранение кислородно-транспортной функции гемоглобина соответственно.

Как только кровь покинула сосудистое русло донора и была стабилизирована и консервирована, начинаются необратимые процессы «старения» крови. Постепенно происходит снижение физиологической полноценности эритроцитов, в первую очередь страдает их кислородно-транспортная функция. Вторые сутки знаменуются утратой физиологической полноценности лейкоцитов и тромбоцитов, разрушением антигемофильного глобулина. Неделю спустя начинают гибнуть лимфоциты и укорачивается полупериод жизни эритроцитов. С середины третьей недели хранения начинается спонтанный гемолиз эритроцитов.

3.2. Криоконсервирование эритроцитов

3.2.1. Общие сведения

Цельная кровь при положительных температурах (+2. +6°С) может сохраняться в течение ограниченного периода времени. При использовании раствора глюгицира потеря функциональной активности клетками крови происходит к концу третьей недели хранения в результате истощения содержания ферментов и коферментов, ответственных за поддержание метаболических процессов. А при условии добавления метаболитов углеводно-фосфорного обмена срок сохранения полноценных эритроцитов удлиняется до 30–35 дней. При этом по мере увеличения срока хранения ухудшаются морфофункциональные свойства эритроцитов. Поэтому был разработан метод хранения эритроцитов при ультранизких температурах, позволяющий сохранять клетки крови в биологически полноценном состоянии в течение многих лет. Для предотвращения гибели или повреждения клеток при замораживании к ним в определенных соотношениях добавляются специальные химические агенты, так называемые криопротекторы, или криофилактики, а сам метод получил название криоконсервирования.

Криопротекторы в зависимости от механизма ограждающего действия на клетки делят на две группы:

эндоцеллюлярные (т.е. проникающие внутрь клетки);

экзоцеллюлярные (т.е. не проникающие внутрь клетки).

Криопротектором первой группы является глицерин. В силу того, что он быстро проникает в эритроциты, его широко применяют для криоконсервирования эритроцитов. Механизм его защитного действия еще окончательно не изучен, но уже сейчас можно говорить о том, что глицерин влияет на процессы как внутриклеточной, так и внеклеточной кристаллизации, отдаляя и замедляя ее наступление по мере понижения температуры. Он также оказывает структурирующее влияние на внутриклеточную воду.

У глицерина есть один существенный недостаток – он является гиперосмолярным веществом по отношению к плазме крови. Из-за этого эритроциты, замороженные с ним, нельзя сразу после оттаивания переливать больному или помещать в любую изотоническую среду, поскольку глицери-низированные эритроциты начинают притягивать на себя воду из плазмы, быстро увеличиваются в объеме, теряют стойкость и разрушаются, т.е. имеет место так называемый осмотический шок, или осмотический гемолиз. Поэтому криоконсервированные в глицерине эритроциты перед трансфузией больному подвергаются специальной обработке – отмыванию.

3.2.2. Методы замораживания эритроцитов

В клинической практике для консервирования эритроцитов крови человека используют два основных метода замораживания:

быстрое – со скоростью охлаждения несколько градусов в секунду,

медленное – со скоростью снижения температуры несколько градусовв минуту.

Есть еще и третий метод замораживания – это так называемое ультрабыстрое замораживание. При этом методе скорость охлаждения достигает 100° в секунду. Но он не получил применения в клинической практике из-за того, что достаточно большие объемы крови (250–500 мл) замораживать таким образом просто невозможно.

Поэтому более подробно остановимся на основных методах замораживания эритроцитов.

3.2.2.1. Быстрое замораживание эритроцитов

В настоящее время замораживание, хранение и отмывание эритроцитов перед их введением больному осуществляется в отделениях долгосрочного хранения крови (банках крови), располагающих для этого соответствующей аппаратурой и штатами.

Первым этапом является заготовка крови. Кровь от доноров заготавливают во флаконы емкостью 250 и 500 мл или в пластиковые контейнеры, содержащие консервант. Как правило, замораживанию подвергается кровь со сроком хранения 2–3 дня. Кровь более поздних сроков хранения, а также свежую кровь замораживать не желательно.

Вторым этапом является разделение жидкой и клеточной частей крови. Плазму отсасывают и используют для переливания или приготовления препаратов крови. Эритроциты же смешивают с криоконсервантом в соотношении 1:1. Обычно используется консервант следующего состава:

Третий этап – смешивание эритроцитов с криофилакти-ком. Оно производится путем медленного добавления его во флакон или пластикатный контейнер с эритроцитами при постоянном помешивании. Это необходимо для постепенного и равномерного смешивания глицерина с эритроцитами. Добавление же эритроцитов в криоконсервант категорически не допускается, так как это ведет к развитию гемолиза.

На четвертом этапе эритроциты, смешанные с криофи-лактиком, помещаются в специальные контейнеры. Они представляют собой емкости из дюралюминия объемом 250 мл. Их особенностью является наличие гофрированных стенок. Такая форма позволяет увеличить поверхность соприкосновения с окружающей средой, а это в свою очередь позволяет ускорить теплоотвод при замораживании и увеличить приток тепла при оттаивании эритроцитов. Одна доза замороженных эритроцитов по объему составляет 125 мл.

Для герметизации контейнеров применяются специальные тефлоновые колпачки. Использование этого материала оправдано тем, что он является инертным в химическом отношении, а так же тем, что при охлаждении его объем уменьшается в большей степени, чем у дюралюминия, и тем самым достигается полная герметизация контейнера. Это абсолютно необходимо, потому что если в негерметичный контейнер попадет жидкий азот, то при размораживании резкое увеличение объема газа в контейнере приведет просто-напросто к его взрыву.

После смешивания эритроцитов с ограждающим раствором необходимо выждать не менее 15 мин и только после этого переходить к замораживанию. Это время требуется для полного проникновения глицерина в эритроциты. Если это будет меньше требуемого, то большинство эритроцитов погибнет при замораживании–оттаивании. Одинаково нежелательно и увеличение времени выжидания, так как это повышает вероятность проявления токсических эффектов глицерина в отношении эритроцитов, которые возникают при комнатной температуре. В результате этого большинство эритроцитов может быть повреждено или гемолизировано еще до начала процесса замораживания.

Герметизированные контейнеры маркируются – на них пишется номер, Ф.И.О. донора, группа крови по системе АВ0 и резус-фактору. После этого данный контейнер регистрируется в специальном журнале – все данные с этикетки на флаконе крови, которая замораживается, переписываются в него. Также в этом журнале указывается дата замораживания.

Пятый этап – собственно замораживание. Этот процесс осуществляется в специальной емкости, наполненной жидким азотом. При проведении замораживания емкость постоянно покачивается. Весь процесс охлаждения от +20. +25 до –196°С занимает около 2 мин. После окончания замораживания емкость открывается и контейнеры с помощью специальных щипцов быстро перемещаются в сосуд Дьюара, также содержащий жидкий азот. Емкость этого сосуда составляет 5 л. После завершения замораживания всей партии сосуд Дьюара подносят к хранилищу биопродуктов и помещают в него контейнеры с эритроцитами. Над каждым хранилищем имеется схема расположения контейнеров и в свободную ячейку (куда помещается контейнер) вписывается карандашом его регистрационный номер.

Процесс размораживания происходит следующим образом. Когда возникает необходимость в размораживании контейнера, его специальными щипцами извлекают из ячейки хранилища биопродуктов, помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом и подносят к емкости для размораживания. Она представляет собой металлический сосуд, снабженный элементами для нагревания воды и терморегулятором, который отключает элементы при достижении температуры +45°С. Эта емкость также снабжена устройством для ее постоянного покачивания. Отогрев контейнеров от –196 до +4°С осуществляется за 23–25 с. Достигать более высокой температуры при оттаивании нежелательно из-за возможности нарастания степени гемолиза.

3.2.2.2. Отмывание эритроцитов (деглицеринизация)

Как уже говорилось выше, эритроциты, консервированные с глицерином, нельзя сразу же после оттаивания переливать в сосудистое русло. Предварительно необходимо провести их деглицеринизацию. Этот процесс сводится к отмыванию оттаявших эритроцитов гиперонкотическими растворами с понижающейся концентрацией. В результате добиваются снижения уровня глицерина в клетках до 0,3–0,45%, что делает безопасным введение таких эритроцитов в сосудистое русло реципиента.

Существует несколько методов проведения процесса отмывания эритроцитов:

непрерывное центрифугирование на фракционаторах или сепараторах крови;

Наиболее часто в практике используется метод серийного центрифугирования.

Технически этот процесс осуществляется следующим образом:

Приготовление одной дозы эритроцитов методом серийного центрифугирования требует использования 1150 мл растворов. Ресуспендирование эритроцитов можно проводить на растворах ЦОЛИПК-8в, гемодезе, реополиглюкине, альбумине или других.

На флакон с взвесью криоконсервированных эритроцитов наклеивается этикетка, на которой кроме обязательных данных о доноре, группе крови по системе АВ0 и резус-принадлежности указывается срок хранения эритроцитов, после которого переливание их реципиенту крайне не желательно.

Срок хранения размороженных эритроцитов при температуре +4±2°С колеблется от 1 до 3 недель, но большинство авторов рекомендует использовать их в течение трех первых суток.

3.2.2.3. Замораживание эритроцитов при умеренно низких температурах

Как уже говорилось ранее, для медленного замораживания эритроцитов используют холодильники различной конструкции с разным объемом замораживающей камеры. Они должны удовлетворять требованию по поддержанию температурного режима в пределах –40. –80°С. Для замораживания эритроцитов в холодильнике используют пластиковые контейнеры емкостью 500 мл. Данная методика позволяет довести конечное содержание глицерина в растворе до 40%. Поэтому при добавлении ограждающего раствора требуется известная осторожность с целью предупреждения осмотической травматизации эритроцитов. Криоконсервант и эритроциты при смешивании должны быть комнатной температуры. Время выжидания (эквилибрационный период) перед помещением контейнера в холодильник при использовании данной методики увеличивается до 30 мин. После этого контейнер в горизонтальном положении помещается в морозильную камеру.

Размораживание эритроцитов, замороженных по данной методике осуществляется в водяной бане при температуре +37°С при постоянном покачивании. Весь процесс оттаивания длится 6–8 мин.

Учитывая то, что концентрация глицерина в смеси более чем в 2,5 раза превышает таковую при замораживании эритроцитов в жидком азоте, процесс деглицеринизации носит более сложный характер.

Сначала в контейнер добавляют 12% раствор хлорида натрия, а после центрифугирования и отсасывания надоса-дочной жидкости отмывание производится еще трижды 1,6% растворами хлорида натрия с добавлением буфера. Отмытые таким образом эритроциты ресуспендируют в равном объеме плазмозамещающего раствора.

Замораживание эритроцитов при умеренно низких температурах обладает рядом существенных преимуществ перед быстрым замораживанием. Во-первых, криоконсервированные таким образом эритроциты дешевле. Во-вторых, данная методика более проста в техническом плане. В-третьих, она безопасна.

Эритроциты, замороженные при умеренно низких температурах и в жидком азоте, после деглицеринизации хранятся и используются одинаково.

3.2.3. Применение криоконсервированных эритроцитов в клинике

Показания к назначению размороженных эритроцитов аналогичны таковым при назначении нативной эритровзвеси или нативных отмытых эритроцитов. Но при этом надо учитывать целый ряд преимуществ, которыми обладает взвесь размороженных эритроцитов. Первым и основным преимуществом является то, что в процессе криоконсервирования и деглицеринизации из взвеси эритроцитов удаляются все другие клеточные элементы крови, вазоактивные вещества, калий и антикоагулянты, входящие в состав гемоконсерванта. Кроме того, в отмытой эритровзвеси остаются наиболее устойчивые эритроциты, потому что старые и нестойкие эритроциты полностью удаляются на этапах подготовки к трансфузии.

Вторым важным преимуществом является то, что из взвеси размороженных эритроцитов в процессе отмывания практически полностью удаляются вирусы гепатита В, а также ни А ни В. Причем, чем больше кратность отмывания, тем меньше вероятность заражения реципиента этой инфекцией при переливании ему размороженной эритровзвеси.

Третье преимущество состоит в том, что размороженные эритроциты практически лишены аллергизирующих свойств, так как основные иммунизирующие факторы удаляются в процессе отмывания.

Противопоказания для переливания криоконсервированных эритроцитов те же, что и для нативных.

Переливание размороженных эритроцитов осуществляется через систему с фильтром с обязательным выполнением всех проб на совместимость и трехкратной биологической пробы. После переливания взвеси из размороженных эритроцитов за больными необходимо наблюдение в течение 3 ч для предупреждения развития возможных побочных реакций (термометрия и общий анализ мочи). По мнению большинства авторов, реакции при переливании криоконсервированных эритроцитов регистрируются в несколько раз реже, чем при переливании нативных эритроцитов.

Источник