СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ АНАТОМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И ИХ ХРАНЕНИЕ В ПАРАХ ФОРМАЛИНА ДЛЯ МУЗЕЙНЫХ ЦЕЛЕЙ
Свежий трупный материал промывают под проточной водой, вымывая содержимое сосудов и полостных органов (кишечник, желудок). После промывки под струей воды, материал погружают в емкость с холодной водой, желательно поставить емкость под проточную воду либо менять воду 3-4 раза в сутки. Материал промывают в течение 24-48 часов в зависимости от его размеров. Тщательно промывают кишечник, желудок, полости сердца и крупные сосуды. После чего материал погружают на 1-6 месяцев в 3% раствор формалина для предварительной фиксации.
Зафиксированный материал перед препарирования промывают под проточной водой в течении 12-24 часов. После окончания препарирования, препарат нашивают на стекло и погружают в 20% раствор формалина с добавлением глицерина, количество которого должно быть не менее 30%, лучше 50%. В данном растворе препарат находится в течение 1-6 месяцев, в зависимости от объема препарата. После пропитывания препарата раствором формалина с глицерином его вынимают и просушивают в вертикальном положении в течении 1 часа. После чего на препарат наклеивают нумерацию.
Номера наклеивают 10% раствором желатина по часовой стрелке сверху вниз, приклеенный номерок желательно полностью покрывать желатином. Затем препарат выдерживают на воздухе 15-20 минут. После чего препарат погружают в 40% раствор формалина на 5-10 минут для фиксации желатина. Вынув препарат из 40% раствора формалина, ему дают стечь и покрывают 70% раствором глицерина. На этом изготовление препарата заканчивается.
Для хранения и экспонирования таких препаратов в музее, предлагается такой способ.
На дно анатомической посуды укладывают слой ваты, обвернутой в фильтровальную или промокательную бумагу. Толщина слоя может быть от 1 до 5 см, в зависимости от объема посуды и размера препарата.
На подготовленный слой ваты наливают 40% раствор формалина, до уровня слоя ваты (так чтобы формалин не выступал на поверхность слоя). После чего в банку помещают предварительно препарат, приготовленный указанным ранее способом.
Для того, чтобы стенки банки не запотевали их изнутри смазывают тонким слоем вазелинового масла. Банку с препаратом закрывают герметично, для чего используют клей «Контактол» (для склеивания стекла). Его наносят тонкой колбаской на верхний край банки и сверху кладут стекло, вырезанное по форме и размеру соответствующему данной посуде. Стекло слегка придавливают к банке. Можно положить небольшой груз. В таком положении клею дают высохнуть в течение суток.
Таким образом, применяя этот метод хранения и экспонирования препаратов в музее, мы имеем ряд преимуществ: малый расход формалина, значительное уменьшение веса банки с препаратом, нет искажения объема препарата. Препараты, сохраняющиеся таким способом, не теряют своей наглядности в течение неопределенно долгого срока.
Заготовка, консервирование и хранение органов и тканей
ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ
В зависимости от анатомической зоны, в которую помещают трансплантат выделяют ОРТОТОПИЧЕСКУЮ трансплантацию (орган помещают на свое анатомическое место) и ГЕТЕРОТОПИЧЕСКУЮ трансплантацию (орган перемещают в иное, не предназначенное ему природой место).
Помимо пересадки органов, в трансплантологии последних лет появилось новое перспективное направление клеточной трансплантации, когда с целью восстановления функции в организм реципиента пересаживаются культивированные клетки органа.
Источником тканей и органов для трансплантации являются практически здоровые люди погибшие от случайных причин (тяжелых травм не совместимых с жизнью) или скончавшиеся в результате остро развившихся тяжелых заболеваний (инфаркт миокарда, инсульт и т.п.). Наиболее оптимальным для трансплантологии источником являются близкие родственники пациента нуждающегося в пересадке органа или тканей. Это обусловлено тем, что при изогенной или сингенной трансплантации реакция тканевой несовместимости выражена мало и наступает достаточно быстрое выздоровление реципиента. Однако изогенная и сингенная трансплантация возможна только парных органов.
Другим, не менее важным источником для трансплантологии являются ткани трупа (кожа, сухожилия, кости, роговица и т.д.).
Несколько реже в качестве источника тканей для трансплантации используют животных.
Медицинским противопоказанием к изъятию тканей и органов для трансплантации являются все случаи смерти от инфекционных заболеваний, острых и хронических отравлений, злокачественных опухолей, туберкулеза, а также случаи смерти ВИЧ инфицированных пациентов и больных СПИД.
Важным моментом заготовки органов и тканей для аллотрансплантации являются не только медицинские, но и морально-этические и юридические аспекты. Забор органов и тканей должен производится с согласия родственников, после констатации врачебной комиссией смерти мозга потенциального донора. В состав этой комиссии входят: анестезиолог; хирург или нейрохирург; невропатолог; психиатр; лечащий врач. Критерием установления диагноза смерти мозга служат: 1.Глубокая безрефлекторная кома; 2.Отсутствие кашлевого рефлекса при эндотрахеальном отсасывании; 3.Полный центральный паралич дыхания; 4.Изоэлектрическая (нулевая линия) при электроэнцефалографии; 5.Интракраниальная остановка кровообращения (доказанная с помощью ангиографии). Констатация смерти мозга комиссией осуществляется в письменном виде с подписями всех ее членов.
Забор, консервирование и хранение органов и тканей для трансплантации производят при строгом соблюдении правил асептики и антисептики в специально оборудованных лабораториях-операционных центров трансплантологии, НИИ и их филиалов. Изъятие органов у донора выполняют сразу же после констатации комиссией смерти мозга, на фоне внутривенных вливаний донору растворов электролитов, диуретиков, ангиопротекторов, а также при проведении искусственной вентиляции легких. Эти мероприятия имеют цель сохранить функции донорских органов до конца операции их изьятия. не рекомендуется выполнять забор органов в период тепловой ишемии (период времени, когда циркуляция крови уже прекращена, а температура тканей еще близка к нормальной).
Ткани трупа изымают и консервируют в первые 6 часов после смерти. Консервирование тканей трупа возможно в течение первых суток при условии хранения их в специальных условиях при температуре 0 0 С.
После изъятия органы и ткани вначале тщательно отмывают от крови и тканевой жидкости в специальных растворах, а затем, в зависимости от предполагаемой длительности хранения, приступают к консервированию.
Существуют следующие методы консервирования тканей и органов:
2. Консервирование в специальных растворах, содержащих антибиотики или антисептики, с последующим хранением в плазме или крови реципиента или охлажденном растворе;
4. Консервирование в парафине;
5. Консервирование в растворе альдегида (глютаральдегид, формальдегид).
После консервирования материал хранят в специальных условиях в центрах и НИИ трансплантологии, создавая таким образом банк органов и тканей. Доставка органов для трансплантации в хирургические клиники и отделения осуществляется в специальных контейнерах в растворе при температуре +4 0 С.
Современный подход к проблеме консервации органов характеризуется общебиологическими позициями, а также использованием кибернетических методов исследования. Выяснено, что чувствительность пересаживаемых органов к гипоксии настолько велика, что даже кратковременная ишемия приводит к той или иной степени их функционального повреждения. Главная задача консервации состоит в создании таких условий, при которых энергетические траты изолированных органов могли бы максимально продолжительное время адекватно восполняться.
На современном этапе существуют два основных, прямо противоположных пути решения этой задачи: во-первых, использование методов, напранленных на обратимое снижение всех видов обмена до возможно более низкого уровня; во-вторых, применение способов поддержания органного (а при консервации тканей или клеток — соответственно тканевого или клеточного) обмена на нормальном уровне с полным сохранением функциональной способности изъятых из организма органов и тканей. Среди методов, обеспечивающих реализацию первого пути, следует выделить три основных: 1) фармакологическое воздействие; 2) гипотермию и гипербарическую оксигенацию; 3) замораживание.
Фармакологическое воздействие на клеточный метаболизм возможно путем применения различных ингибиторов окисления (например таких, как анаболический стероид — анаболии), стимуляторов гликолитических процессов, веществ, акцентирующих протоны водорода, а также веществ, стабилизирующих внутриклеточные мембраны (например, магнезии). К сожалению, метод фармакологического воздействия при консервации органов еще мало изучен и почти неуправляем. Гораздо более перспективным является применение гипотермии (самостоятельно и в комбинации с гипербарической оксигенацней и перфузией).
В основе защитного действия гипотермии лежит снижение функциональной активности органов, ведущее к торможению обменных процессов и снижению потребности в кислороде. Применяются внутреннее охлаждение органа (путем перфузии через артериальную систему) и наружное охлаждение (путем погружения органа в охлажденный отмывающий раствор).
Однако исследования показали, что после консервации органа в условиях гипотермии уже через несколько часов наступают метаболические нарушения, вызванные ферментативным дисбалансом, что объясняется различными температурными характеристиками многочисленных клеточных ферментов. Кроме того, в условиях гипотермии снижается константа диссоциации органических кислот, что улучшает их диффузию через клеточные мембраны и усиливает их токсичность. Сложности методического порядка не позволяют пока определить оптимальный температурный режим и скорость охлаждения.
Все это заставляет сочетать гипотермию с другими методами: наибольшее распространение получили усиление (пролонгирование) защитного действия гипотермии с помощью фармакологических средств и в особенности (пока в основном в эксперименте) сочетание гипотермии, перфузии и гипербарической оксигенации.
Аппараты для консервации органов должны включать в себя протез сердца (насос), протез легких (оксигенатор), протез внутренней среды (нерфузат) н протез контуров регулирования (систему управления консервацией). Создание таких аппаратов связано с большими техническими сложностями, особенно при устройстве системы управления, и с рядом трудностей биологического характера. Тем не менее созданная в России система жизнеобеспечения консервируемых органон, включающая систему получения информации, обработки ее на математической модели, выбора оптимальных режимов управления насосом, оксигенатором, коррекции состава перфузата и анализатор жизнеспособности органа, уже позволила удлинить сроки консервации органов до 48 ч в эксперименте и до 24 ч в клинике.
В нашей стране разработан принципиально новый способ гипотермической консервации почки с помощью трансорганной газовой перфузии: газ (чистый кислород, кислородно-гелиевая и карбогенная смеси) непрерывным потоком под давлением, не превышающим 60 мм рт. ст., нагнетается в почку одновременно через артерию, вену и мочеточник, пронизывая весь орган; газ диффундирует по направлению к его наружной поверхности и свободно выходит в окружающую среду.
Разрабатываются методы консервации, основанные на замораживании органов и тканей. Достигнуты некоторые положительные результаты и области консервации с помощью низкой температуры таких тканей, как кожа, кости, костный мозг и аорта. Были предприняты попытки замораживания целых органов, таких, как сердце, печень, почка. При этом использовали криофилактики (растворы глицерина и диметилсульфоксида), оттаивание производили различными способами (в том числе с помощью микроволновой радиации). Однако метод консервации органов при помощи замораживания при всей своей перспективности еще далек от окончательной разработки.
Консервирование органов и тканей (латинское conservare хранить, сохранять) — методы воздействия на изолированную от целостного организма часть (ткань, орган, конечность, комплекс органов) физическими, химическими и биологическими факторами, позволяющими сохранить ее жизнеспособность и полноценную функцию в течение значительного времени существования вне организма; используется с заместительной целью при восстановительных операциях.
Консервирование органов и тканей является вспомогательным мероприятием и этапом трансплантации органов и тканей. Впервые консервирование целого органа (сердца) осуществил А. Вюльпиан в 1852 г., подшивание консервированного органа (крысиного хвоста) — Бер (P. Bert, 1882), успешную пересадку консервированных кровеносных сосудов в эксперименте — А. Каррель (1908). В клинике наиболее широко консервирование тканей (роговица) было использовано В. П. Филатовым (1934). Консервирование органов и тканей широко распространено в хирургических учреждениях, занимающихся трансплантацией органов и тканей.
Прекращение доставки кислорода и питательных веществ, наступающее после остановки кровообращения, по-разному действует на различные органы: одни быстро погибают, другие — продолжают оставаться жизнеспособными. Органы и ткани, сохраняющие функц. способность в течение определенного времени после их изоляции от целостного организма, называются переживающими органами и тканями.
Например, после прекращения кровообращения мозг погибает через 5— 6 минут, печень через 20—30 минут, почки через 40—60 минут, сердце через 60 минут, а конечность может оставаться жизнеспособной в этих условиях в течение 4—6 часов. Клетки организма обладают некоторым запасом питательных веществ, но не имеют запасов кислорода, поэтому в нарушении их жизнедеятельности первостепенную роль играет аноксия. В отсутствие кислорода энергетические потребности клеток покрываются за счет бескислородного расщепления глюкозы, что приводит к накоплению недоокисленных продуктов (молочной кислоты и других) и закислению внутренней среды ткани или органа (смотри Ацидоз). При ацидозе повреждаются клеточные мембраны, нарушаются внутриклеточные структуры, освобождаются ферменты, вызывающие самопереваривание клеточных структур (смотри Аутолиз), что приводит к гибели ткани или органа. Для уменьшения повреждений в изолированных тканях и органах применяют два вида воздействия: заместительное консервирование (искусственное поддержание обмена веществ путем доставки кислорода и питательных веществ) или консервирование, подавляющее обмен веществ (искусственное снижение уровня обменных процессов, а следовательно, и потребности в кислороде, питательных веществах и так далее). При консервировании органов и тканей иногда используют сочетание обоих видов воздействия. Органы и ткани в зависимости от их роли в организме условно разделяют на две группы: гомовитальные и гомостатические. Гомовитальные трансплантаты должны сохранять двигательную или секреторную активность, а также способность клеточных элементов к размножению, то есть должны быть жизнедеятельными. Гомостатические трансплантаты выполняют опорную или покровную функцию, и сохранение жизнедеятельности их клеток не обязательно. Поэтому требования к консервированию различных трансплантатов разные. Естественно, что консервирование гомовитальных трансплантатов должно быть более физиологичным, чем гомостатических. Консервирование органов и тканей, как правило, не оказывает существенного влияния на ослабление иммунологической несовместимости сохраняемого органа или ткани, поскольку несовместимость определяется, в конечном счете, различием наследственных (генетических) признаков. Однако оно позволяет располагать временем от момента получения трансплантата до пересадки, за которое можно произвести подбор наиболее совместимого реципиента, что увеличивает вероятность благоприятного исхода трансплантации. В отдельных случаях при консервировании гомостатических трансплантатов (кожа, сердечные клапаны) в растворах альдегидов (формальдегид, глутаральдегид) отмечено снижение проявлений иммунологической несовместимости за счет уменьшения в трансплантатах количества водорастворимых белков и эффекта «маскировки», наступающего в результате химической связи альдегида с белковыми компонентами тканей.
Отделения консервирования органов и тканей или учреждения, располагающие запасом консервированных трансплантатов (органов и тканей), типированных по иммунологическим факторам совместимости, и производящие обмен ими с другими лечебными учреждениями как внутри страны, так и за ее пределами, называются банками тканей и органов.
Консервирование позволяет заготовлять органы и ткани, создавать запасы трансплантатов в банке тканей для использования их по мере необходимости, производить обмен трансплантатами между различными медицинскими учреждениями, подбирая наиболее подходящие по иммунологической совместимости для реципиента, находящегося иногда за многие сотни километров от места получения трансплантата. Консервируют такие органы, как сердце, кровеносные сосуды, легкие, трахею, печень, почки, железы внутренней секреции, кишечник, конечности, зубы, костный мозг, суставы и ткани — кровь, кожу, кость, хрящ, фасции, роговицу, склеру, плевру, перикард, брюшину, сердечные клапаны, нервы, сухожилия, мышцы, стенку мочевого пузыря, уретру, твердую мозговую оболочку.
Заготовка трансплантатов
Заготовка трансплантатов осуществляется в судебно-медицинских моргах или других медицинских учреждениях от погибших людей, а также от животных на скотобойнях или мясокомбинатах. Изъятие органов производят в первые 20—30 минут после констатации смерти донора, а тканей — в первые 2 — 24 часа. Существуют два способа заготовки трансплантатов: 1) в условиях строгой асептики; 2) без строгого соблюдения правил асептики. Наиболее распространен способ заготовки в условиях строгой асептики. При этом все манипуляции осуществляются в специальной операционной с использованием стерильного инструментария и белья. При заготовке опорных и покровных тканей иногда применяют второй способ. При этом трансплантаты после заготовки стерилизуют растворами антисептиков, антибиотиков или подвергают гамма-облучению.
Способы консервирования органов и тканей
Способы консервирования органов и тканей зависят от вида воздействия на трансплантат. 1. Заместительное консервирование: 1) биологическая перфузия; 2) нормотермическая аппаратная перфузия. 2. Консервирование, подавляющее обмен веществ: 1) охлаждение до температуры, близкой к 0°, в жидких солевых средах или в других жидкостях без питательных веществ: а) гипотермическая перфузия, б) проточный метод, в) бесперфузионный метод; 2) охлаждение в твердых средах до температуры, близкой к 0°; 3) замораживание при температуре ниже 0°:
а) при температуре от 1 до —50°,
б) при температуре от — 51 до —100°,
в) при температуре от — 101 до —273°,
г) замораживание с высушиванием (смотри Лиофилизация). 3. Комбинированное (заместительное и подавляющее обмен веществ) консервирование:1) гипотермическая перфузия плазмозамещающими растворами; 2) гипотермияв сочетании с гипербарической оксигенацией; 3) сочетание гипотермии, гипербарической оксигенациии перфузии; 4) бесперфузионное охлаждение до температуры, близкой к 0°, в жидких средах, содержащих кровь, плазму, сахара, АТФ и другое.
Заместительное консервирование.
Биологическая перфузия — применение в эксперименте В. П. Демиховым (1963, 1970) изолированного сердечно-легочного препарата или сердечно-висцерального комплекса для сохранения входящих в них органов, а также экстракорпоральное подключение органов к сосудам реципиента или промежуточного донора — является разновидностью этого способа консервирования органов и тканей. Биологическая перфузия отличается от обычного кровоснабжения органа лишь тем, что трансплантат находится вне организма; при этом необходимы стерильные термостатические камеры для сохраняемых органов и дыхательный аппарат для вентиляции легких в сердечно-легочном препарате. При использовании сердечно-легочного препарата без замены крови сердце сокращается не более 2—2½ часов, а в случае периодической замены циркулирующей крови — 5—8 часов. Лавендеру (Lavender) с соавторами (1966, 1968) при экстракорпоральном подключении почки к больному в отдельных случаях удавалось поддерживать ее жизнеспособность до 25 дней. Использование сердечно-легочного препарата для консервирования органов и тканей пока не нашло применения в клинике ввиду сложностей морально-этического и правового характера, связанных с изъятием комплекса органов из трупа и их «оживлением». Кроме того, возникают трудности в управлении дыханием, кровообращением и в поддержании постоянства внутренней среды. Экстракорпоральное подключение органов также пока имеет ограниченное применение ввиду организационных трудностей. К тому же пребывание у промежуточного донора может усилить иммунологическую несовместимость консервированного органа за счет антигенов, адсорбируемых органом при консервировании.
Нормотермическая аппаратная перфузия отличается от предыдущего вида консервирования тем, что циркуляция крови в изолированном органе осуществляется с помощью аппарата искусственного кровообращения. В качестве примера можно сослаться на широко известный случай перфузии изолированной головы собаки с помощью автожектора конструкции С. С. Брюхоненко (1930). При этом способе удается сохранить жизнеспособность сердца и печени в течение 3—6 часов, почки — до 3½ суток. Трудности в поддержании постоянного состава перфузионной крови, постепенное накопление в крови конечных продуктов обмена, разрушение эритроцитов в аппарате искусственного кровообращения являются недостатками этого метода консервирования.
Подавляющее обмен веществ консервирование
Подавляющее обмен веществ консервирование включает наиболее обширную группу методов, основанных главным образом на защитном действии охлаждения или замораживания. Вариантами являются способы консервирования органов и тканей охлаждением в жидких солевых средах до температуры, близкой к 0½. Гипотермическая перфузия солевыми растворами по результатам несколько уступает гипотермической перфузии с белково-содержащими растворами из-за наступления более выраженного отека органа, однако позволяет сохранять почки до 24 час. Проточный метод отличается от гипотермической перфузии тем, что циркуляция жидкости осуществляется не через кровяное русло, а происходит обмывание трансплантата снаружи в расчете на диффузионные процессы через ткани; этот метод консервирования является промежуточным между перфузионным и бесперфузионным методами. Проточный метод применяют для консервирования органов и тканей и эндокринных желез. Установка монтируется в бытовом холодильнике и настраивается на протекание нескольких капель жидкости в минуту. Сроки консервирования этим методом от 1 до 4 недель.
Бесперфузионное охлаждение в жидких средах до температуры, близкой к 0½, благодаря своей простоте и доступности имеет довольно широкое применение при консервировании органов и тканей. Для увеличения времени консервирования почки обмен веществ в ней подавляют, кроме снижения температуры, также другими воздействиями: используют умеренно гиперосмотичные растворы, вызывающие торможение диффузионных процессов; применяют гиперкалиевые растворы, искусственно выравнивающие трансмембранные ионные градиенты и экономящие энергию, затрачиваемую на работу клеточных «насосов»; добавляют в состав отмывочных растворов вещества с антиоксидантными свойствами (гамма-оксимасляную кислоту и другие). При консервировании бесперфузионным методом удаленные почки отмывают охлажденным раствором под давлением 60—80 мм рт. ст. через артерию до появления из вены чистой оттекающей жидкости. На отмывку одной почки требуется 600— 1000 мл перфузата, длительность отмывки 2—5 минут. Отмывочный раствор представляет собой либо изотонический раствор хлорида натрия с добавлением 0,5— 1 мл гепарина и 5—10 мл 10% раствора новокаина на 1000 мл жидкости, либо специальный консервирующий раствор (гиперосмотичный, гиперкалиевый, с антиоксидантами). После отмывки почки помещают в двухстенный контейнер (рис. 1), где поддерживается температура от 0 до 2°, и доставляют в клинику по месту нахождения реципиента. Почки при этом сохраняются до 18—22 часов.
Рис. 1 Схема контейнера для консервирования и транспортировки органов и тканей: 1 — ручка контейнера; 2 — термоизолирующая прокладка корпуса контейнера; з — крышка герметичной камеры для содержания органа в консерванте; 4 — корпус герметичной камеры; 5 — двухстенный корпус контейнера; 6 — орган (почка) в консервирующем растворе; 7 — куски льда.
Для консервирования органов и тканей бесперфузионным охлаждением в жидких средах используют большое число различных жидкостей: простые химические среды (изотонический и гипертонический растворы хлорида натрия, жидкость Тирода, раствор Рингера—Локка, водные растворы бриллиантового зеленого, слабые растворы карболовой кислоты, растворы хлорамина, мертиолата, циалита, диоцида, бетапропиолактона, фурацииша, формальдегида, глутаральдегида, этилового спирта, синтетический каучук СКТН); сложные химические среды (раствор Ханкса, раствор Л-6 с цитратом натрия, трифлавином и так далее, буферный физиологический раствор с антибиотиками, глюкозо-цитратно-пенициллиновый раствор, холодоустойчивые среды Белякова — 4-е, 31-е, 31-ж, 32-е, раствор ФС с лимонной кислотой и риванолом, раствор ЦОЛИПК, раствор с лактатом натрия, раствор Федотенкова, среда Берингера с антигистаминными препаратами, растворы ЛКГ-1 и ЛКГ-2 с желатиной и гепарином, раствор «Желатиноль» и так далее). Консервирование тканей бесперфузионным охлаждением в жидких средах осуществляется в бытовом холодильнике в обычной стеклянной посуде. Трансплантаты, консервированные по этому способу, могут храниться от 1 недели до нескольких месяцев. Отдельные способы консервирования органов и тканей (0,1—0,2% растворы формальдегида) позволяют сохранить ткани до 3 лет. Столь продолжительные сроки консервирования при использовании растворов с формальдегидом объясняются химической связью гидратированного формальдегида с ферментами, которая приводит к блокировке их активности и таким образом приостанавливает процесс аутолиза. К недостаткам консервирования органов и тканей в жидких средах относят необходимость периодической замены консервирующих растворов, неудобство транспортировки ввиду хрупкости тары.
Замораживание нашло применение в основном для консервирования тканей. Условно различают три режима замораживания: медленное (от — 1 до —50°), быстрое (от —51 до —100°) и сверхбыстрое (от —101 до —273°). При медленном замораживании из-за образования небольшого числа центров кристаллизации в тканях появляются крупные кристаллы льда, которые повреждают тканевые структуры, при этом сохраняется активность некоторых ферментов, а значит, процесс аутолиза хоть и медленно, но продолжается. При быстром замораживании в сжиженных газах (ацетилен, аммиак, протан, сероводород, этилен и другие) в тканях образуются мелкие кристаллы, приостанавливают свою деятельность ферменты и катализаторы. Сверхбыстрое замораживание в сжиженных газах (кислород, азот и т. д.) приводит к витрификации (остекленению) тканевой воды и к максимальной сохранности биологических структур. Замораживание для консервирования органов (за исключением костного мозга) не применяют, так как кристаллы льда повреждают внутренние структуры гомовитальных трансплантатов, а осуществить сверхбыстрое замораживание целого органа не удается ввиду трудности получения одновременного равномерного охлаждения массивного трансплантата. При консервировании костной ткани используют преимущественно режим от —25 до —35° как наиболее экономичный. Сроки хранения при этом — от нескольких месяцев до 1½ лет. Консервирование органов и тканей замораживанием осуществляют в основном в крупных медицинских учреждениях, так как для этого требуются специальные холодильные установки, вспомогательное оборудование и сжиженные газы.
Разновидностью консервирования замораживанием является лиофилизация. Процесс высушивания осуществляется из замороженного состояния при разрежении 0,0015 атмосфер в течение 24 часов. Высушенные трансплантаты (кожа, кости, артерии), запаянные в стеклянные сосуды, могут сохраняться при комнатной температуре. Использование этого метода требует, кроме холодильных установок, наличия аппаратуры для создания вакуума и запаивания трансплантатов; метод также не позволяет сохранять массивные костные трансплантаты, так как их высушивание и запаивание представляет большие технические трудности. В силу этого лиофилизация имеет ограниченное применение для консервирования тканей.
Комбинированные методы консервирования получили более широкое применение для сохранения органов. Они основаны на сочетании заместительного и подавляющего обмен веществ действий. Снижение уровня обмена веществ при этих методах осуществляется охлаждением или использованием фармакологических средств. Теоретической предпосылкой использования охлаждения для сохранения органов и тканей в изолированном состоянии является феномен Вант-Гоффа, согласно которому снижение температуры на 10° уменьшает потребность ткани в кислороде вдвое, а при t° 2—4° кислородная потребность составляет 4—5% от исходного уровня. Один из видов комбинированного способа консервации органов и тканей — гипотермическая перфузия; она проводится специальными аппаратами с использованием разведенной крови, оксигенированной плазмы или сыворотки, смесью плазмы или сыворотки с растворами Ханкса или Рингера (1 : 4). Этот способ позволяет сохранять почки при t° 10° до 48 часов, а в отдельных случаях до 5 суток.
При гипотермии в сочетании с гипорбарической оксигенацией (повышенное давление кислорода до 4— 5 атмосфер) заместительную роль играет избыток кислорода, который проникает в ткани и вызывает окисление недоокисленных продуктов обмена; охлаждение же в свою очередь снижает уровень обмена веществ. Для этого метода необходима специальная холодильная камера, способная выдержать повышенное давление, баллоны с кислородом, регуляторы давления и температуры. Продолжительность консервирования этим способом составляет для почки 24—48 часов, для сердца 12—24 часа. Подобные же результаты дает сочетание гипотермии, гипербарической оксигенации и перфузии. Ввиду сложности и отсутствия ощутимых преимуществ перед гипотермической перфузией методы, включающие гипербарическую оксигенацию, не получили широкого распространения.
Разновидностью комбинированного способа можно считать также бесперфузионное охлаждение в жидких средах до температуры, близкой к 0°, в присутствии питательных веществ. Для этого применяют биологические среды (кровь или плазму донора, кровь или плазму реципиента, асцитическую жидкость, эмбриональный экстракт), пищевые продукты (растворы глюкозы, пчелиный мед, кипяченое молоко, рыбий жир, яичный желток или белок), синтетические среды (среда 199 — сахара, витамины, пурины, пиримидины, АТФ и так далее; солевые растворы с сывороткой). Вышеперечисленные способы применяются в основном для сохранения тканей и не имеют существенных преимуществ перед консервированием органов и тканей в растворах без добавления питательных веществ.
Стерилизация.
Обеспечение стерильности в процессе консервирование органов и тканей до¬стигается строгим соблюдением правил асептики на всех этапах хранения (стерильная посуда, аппаратура, растворы и так далее), а также обработкой в процессе хранения и перед трансплантацией антисептиками (формальдегид, глутаральдегид, бетапропиолактон, окись этилена, спирт, фурацилин, риванол и другие) или антибиотиками (пенициллин, стрептомицин, тетрациклин, мономицин, хлороцид и другие). Для контроля стерильности в процессе хранения и перед трансплантацией производятся посевы кусочков трансплантатов на питательную среду для бактериологического исследования.
Контроль годности консервированных органов и тканей
Контроль годности консервированных органов и тканей осуществляется различными методами. Условия консервированния органов и тканей сначала отрабатываются в эксперименте на животных и лишь затем внедряются в клин, практику. На обоих этапах — экспериментальном и клиническом — проводятся разнообразные исследования: морфологические (обычная и электронная микроскопия, витальное и суправитальное окрашивание, люминесцентная микроскопия, авторадиография, гистохим. исследование ферментов); электрофизиологические (определение электропроводности, электрического сопротивления); биохимические (изучение активности тканевого дыхания с помощью аппарата Варбурга или полярографа, состояния активности ферментов анаэробного гликолиза, включение в обмен изотопов, изучение синтеза ДНК, определение активности дегидрогеназы с помощью солей тетразоля и другого); исследования культуры тканей в питательной среде; исследование специфической функции органов при восстановлении кровообращения (для почки — выделение мочи, регуляция электролитного состояния крови, выделение индигокармина; для печени — желчеобразование, синтез гликогена и мочевины; для конечности — сохранность электровозбудимости мышц и так далее); исследование функциональной способности органа путем контроля за сроками выживания животных-реципиентов. Функциональные методы контроля годности являются наиболее достоверными и имеют главное значение для проверки гомовитальных трансплантатов. Морфологические, электрофизиологические и биохимические исследования носят вспомогательный характер, так как результаты, полученные при их использовании, отражают частные стороны проявления жизнедеятельности.
Обобщенные сведения по характеристике основных методов консервации органов и тканей приведены в таблице.
Консервирование костного мозга
Способы консервирования.
Для консервирования костного мозга используют два способа: хранение в жидких средах при положительных температурах (2—5°), чем достигается снижение интенсивности обменных процессов в клетках; замораживание и хранение костного мозга при низких и ультранизких температурах (— 70, —196°), что приводит к значительному снижению или полному подавлению обменных процессов.
Консервирование в жидких средах при положительных температурах. Известно, что морфологическая полноценность и функциональная активность клеток костного мозга сохраняются в солевых растворах при t° 2—5° в течение 2 суток, а в средах для культуры тканей — 5 суток. Наибольшее применение в клинической, практике получили консервирующие растворы, разработанные в ЦОЛИПК А. Г. Федотенковым и соавторами (1962) и в ЛИПК Т. К. Мамышевой (1965), основу которых составляют углеводы, белковые компоненты и антикоагулирующие вещества (трехзамещенный цитрат натрия, ЭДТА Na 2 ), необходимые для поддержания обменных процессов в клетках, для создания нормальных осмотических условий и предотвращения явлений свертывания.
Консервирующий раствор ЦОЛИПК № 3 состоит из двух смесей: смеси № 1 (сахароза — 4,3 г, глюкоза — 0,4 г, ЭДТА Na 2 — 0,1 г, вода бидистиллированная — до 50 мл) и смеси № 2 (натрий лимоннокислый трехзамещенный — 1 г, 10% раствор желатины, приготовленной согласно ГФ IX,— 25 мл, вода бидистиллированная — до 50 мл). Смеси № 1 и 2, разлитые во флаконы для взятия крови, стерилизуют раздельно в автоклаве 30 минут при давлении 1,2 атмосферы. Перед применением смеси сливают закрытым способом с соблюдением правил асептики. На 100 мл костного мозга берется 100 мл консервирующего раствора (соотношение 1:1).
Консервирование при отрицательных температурах.
В результате исследований, направленных на изыскание методов длительного консервирования костного мозга, ученым разных стран в 50-х гг. 20 в. удалось найти способы защиты клеток мозга от разрушения с помощью ограждающих веществ, подбора соответствующих скоростей охлаждения и отогрева и выявить условия хранения. Известны 2 группы веществ, обладающих свойствами защиты клеток костного мозга при замораживании. Первая группа включает вещества, проникающие в клетку и обладающие интрацеллюлярным действием (глицерин, диметилсульфоксид, глюкоза и другие), вторая группа — вещества, не проникающие в клетку и обладающие экстрацеллюлярным действием (поливинилпирролидон, полиэтиленоксид, декстран, гидроксиэтил крахмал, желатина, альбумин, сахароза и другие). При замораживании костного мозга человека наиболее ценными оказались 15% раствор глицерина и 8—10% раствор поливинилпирролидона. Защитное действие глицерина основано на свойстве проникать в клетку, формировать прочные связи с водой, благодаря чему снижается процент замерзающей воды и степень концентрации солей в клетке. Добавление его способствует переохлаждению тканей и оказывает влияние на внутри- и внеклеточную кристаллизацию, замедляя рост кристаллов льда. Поливинилпирролидон в клетку не проникает. Он обволакивает клетку, предотвращая ее обезвоживание, образует связи с аминокислотными остатками белков, молекулами воды и электролитами, понижая их концентрацию во внеклеточной среде. Исследования по изучению влияния режимов замораживания и скоростей охлаждения костного мозга на отдельных этапах показали, что весь процесс замораживания костного мозга до t° —196° можно разделить на 3 периода: первый период — это время, в течение которого происходит охлаждение костного мозга с 15% глицерином и 10% сывороткой от исходной температуры до начала кристаллизации со скоростью, не превышающей 3° в 1 минуту; второй период — кристаллизация костного мозга в течение не более 1½ минуты; третий (кристаллизация закончена) — наступает окончательное замерзание биопродукта со скоростью 15—30° в 1 минуту при температуре от —11 до —40°, со скоростью 5° в 1 минуту при температуре от —40 до —196°. Медленное замораживание костного мозга с 15% глицерином неблагоприятно сказывается на эритроцитах. Гемолиз может быть предотвращен путем максимального удаления эритроцитов из костного мозга, что достигается осаждением их с помощью присутствующей в растворе ЦОЛИПК № 3 желатины. Флакон, содержащий костномозговые клетки, центрифугируют в течение 15 минут при 1200 об/мин. Большую часть надосадочного слоя удаляют, оставляя во флаконе 100 мл взвеси. Осевшие на дне флакона клетки костного мозга осторожно ресуспендируют перемешиванием. Далее к этому объему костномозговой взвеси добавляют равный объем надосадочной жидкости, содержащей 30% раствор глицерина и 20% сыворотки крови группы АВ (IV). Затем взвесь клеток костного мозга разливают через систему для переливания крови (с фильтром) по 100 мл в стандартные алюминиевые контейнеры емкостью 160 мл. Экспозиция костного мозга с 15% глицерином до замораживания должна быть 30 минут. Замораживание костного мозга производится по трех-этапной программе: на первом этапе (t° от 10 до —17°) камера программного замораживания «KB 1501 И О» охлаждается со скоростью 1° в 1 минуту, на втором этапе (t° от —17 до —120°) в течение 3 минут производится максимальная подача паров жидкого азота в камеру; на третьем этапе (t° от —120 до —196°) скорость охлаждения камеры составляет 10° в 1 мин. Трехэтапная программа замораживания воспроизводится с помощью специального диска. Она обеспечивает сохранение 90—85% миелокариоцитов и ок. 70% родоначальных гемоиоэтических клеток. Метод замораживания костного мозга с 15% глицерином и 10% сывороткой обеспечивает наилучшую сохранность стволовых гемопоэтических клеток, однако отмывание ограждающего вещества от костного мозга является недостатком этого метода.
При замораживании костного мозга поливинилпирролидоном используется ограждающий раствор Киевского института переливания крови, содержащий 18 г поливинилпирролидона, 10 г глюкозы, 4 г лактозы, 1500 единиц гепарина, 0,015 г левомицетина, до 100 мл бидистиллированной воды; соотношение костного мозга и ограждающего раствора 1:1. Замораживание костного мозга производится на первом этапе (t° от 0 до—18°) со скоростью 1° в 1 минуту, на втором (t° от —18 до —80°) со скоростью 10° в 1 минуту, после чего контейнеры с костным мозгом погружают в жидкий азот.
После размораживания остаются морфологически сохранными 90— 86% миелокариоцитов.
Длительное хранение при ультранизких температурах.
Установлено, что костный мозг доноров после 1—5 лет хранения при t° —196° содержит 85—80% сохранных клеток, то есть почти столько же, сколько при хранении в жидком азоте в течение 1 дня, 1, 3, 6 месяцев. Данные электронно-микроскопического анализа свидетельствуют о том, что клеточные элементы костного мозга, хранившиеся в жидком азоте в течение 1 дня, 6 мес. и 2½ лет, в подавляющем большинстве не претерпевают каких-либо субмикроскопических изменений. Для определения биологической полноценности замороженных костномозговых клеток используют методы in vivo. Так, клонирование кроветворной ткани в селезенке мышей имбредных линий, облученных летальными дозами, показало, что костный мозг, замороженный с 15% глицерином и сохранившийся в течение 5 лет при t° —196°, содержит более 50% стволовых гемопоэтических клеток. Клинические, исследования представляют убедительные доказательства эффективности трансплантаций аутологичного костного мозга, хранившегося при t° —196° с глицерином, поливинилпирролидоном или полиэтиленоксидом в течение длительного времени.
Замораживание с помощью низких температур.
Установлено, что наилучшие результаты замораживания костного мозга с 15% глицерином и 10% сывороткой получены при сочетании разнотемпературных электрохолодильников. С этой целью контейнер с костным мозгом вначале помещают в холодильник с t° —20° для охлаждения до t° —9° (то есть до периода кристаллизации), затем быстро переносят в холодильник с t° —70° и оставляют в нем на хранение. При этом режиме замораживания в первом периоде костный мозг охлаждается со скоростью 2—1½° в 1 минуту, продолжительность зоны кристаллизации составляет 3 минуты, скорость замораживания костного мозга в третьем периоде (посткристаллизационном) составляет 5—3—1° в 1 минуту. Замораживание костного мозга с применением такого режима обеспечивает сохранение в среднем 89% ядросодержащих клеток и 57% стволовых гемопоэтических клеток. Сохранение стволовых клеток в жизнеспособном состоянии при t° —70° обеспечивается в течение 1½ месяца.
Подготовка костного мозга к трансплантации. Значительное влияние на сохранность костномозговых клеток оказывают условия оттаивания замороженного костного мозга. Оптимальным считается быстрое оттаивание костного мозга от —196 до 2° в водяной бане при t° 40—41° за 40—50 секунд. Медленное размораживание костного мозга при комнатной температуре (30 минут) или в холодильнике при t° 4—5° (240 минут) дает низкую сохранность костномозговых клеток, и в частности стволовых. Оттаянную костномозговую взвесь перед трансплантацией закрытым способом (через систему) переводят из алюминиевого контейнера в стеклянные флаконы емкостью 500 мл. К 100 мл оттаянной костномозговой взвеси добавляют 50 мл охлажденного до t° 2—5° глюкозо-сахарозного раствора № 1 (глюкозы — 24,3 г, ЭДТА Na 2 — 0,05 г, 8% раствора сахарозы — до 50 мл). Содержимое флакона перемешивают осторожным покачиванием. Затем дважды добавляют по 150 мл охлажденного до 2—5° раствора № 2 (сахарозы — 24 г, ЭДТА Na 2 — 0,3 г, воды бидистиллированной — до 300 мл) и взвесь перемешивают. После этого флаконы центрифугируют в течение 15 минут при 1200 об/мин при t° 5°. Большую часть надосадочной жидкости (300— 350 мл) удаляют. Осевшие на дно флакона клетки ресуспендируют перемешиванием. Полученную взвесь в объеме 100—150 мл фильтруют через систему для переливания крови во флакон емкостью 250 мл, который герметически укупоривают. Флакон с костным мозгом маркируют, а затем передают для трансплантации. После оттаивания костного мозга и снижения концентрации глицерина до 3,3% с помощью глюкозосахарозных растворов количество сохранных миелокариоцитов не изменяется в первые 4 часа хранения при t° 2—5°. Через 20—24 часа количество сохранных клеток уменьшается на 1 —17%.
Транспортировка.
Размороженный и подготовленный для трансплантации костный мозг может транспортироваться в течение 8 часов по железной дороге, автомашиной, самолетом в изотермических ящиках для крови, поддерживающих t° 2—5°.
Хранение
Хранение костного мозга осуществляют в банках двух типов. Крупные банки создаются при некоторых институтах и на станциях переливания крови; в них должен находиться на хранении аутологичный костный мозг больных и костный мозг доноров, типированный по антигенам гистосовместимости. Банки такого типа должны базироваться на аппаратуре, использующей жидкий азот для замораживания и долгосрочного хранения костного мозга. Для этих целей целесообразно использовать аппараты программного замораживания ФТИНТ АН УССР и Института кибернетики АН Грузинской ССР, а также сосуды на 250 и 500 л жидкого азота, в каждый из которых может вмещаться 260—520 контейнеров с костным мозгом, емкостью на 160 мл каждый. Второй тип — небольшие банки при некоторых лечебных учреждениях (онкологические институты и диспансеры, больницы) и станциях переливания крови. Они предназначены для консервирования на непродолжительные сроки (1—2 месяца) главным образом костного мозга больных, которым после применения повышенных доз цитостатических средств или лучевой терапии потребуется трансплантация аутологичного костного мозга. Для этой цели целесообразно использовать сочетание электрорефрижераторов с t° —20 и —70° (—80, —90°).
Методы оценки жизнеспособности консервированного костного мозга.
Для оценки используют методы прижизненной окраски суправитальными красителями (1% водный раствор эозина, 0,1% раствор трипанового синего) с подсчетом общего числа ядросодержащих клеток костного мозга в камере Горяева. Для полной и многосторонней оценки жизнеспособности костного мозга применяют морфологические, функциональные и биохимические методы исследования, характеризующие биологическую полноценность миелокариоцитов в процессе консервации: изучение клеток в окрашенных мазках, электронная микроскопия, авторадиография, цитологический метод выявления хромосом — маркеров (Т6Т6), использование различий полового хроматина мужских и женских гранулоцитов, изучение фагоцитарной и дыхательной активности клеток костного мозга. Сохранность стволовых гемопоэтических клеток оценивается методом клонирования кроветворной ткани в селезенке смертельно облученных мышей с идентификацией селезеночных колоний гистол. исследованиями и методом определения коммитированных стволовых клеток в культуре на полутвердом агаре.
Контроль качества консервированного костного мозга
Контроль качества консервированного костного мозга осуществляется перед выдачей его для целей трансплантации. При этом каждый флакон с костным мозгом просматривается врачом-специалистом. Основные признаки непригодности костного мозга: нарушение герметичности в укупорке флакона, наличие гемолиза свыше 100 мг%, бактериальное загрязнение, наличие значительных сгустков, низкая сохранность миелокариоцитов (менее 50%). На бактериальное загрязнение костного мозга указывают такие признаки, как помутнение надосадочного слоя, появление пленки, налета, выделение газа. Оценка годности посмертного костного мозга производится по тем же признакам, что и оценка костного мозга доноров. Однако решающее значение имеют еще и результаты патологоанатомического вскрытия трупа и исследования крови на си¬филис и инф. гепатит.
Соловьев Г.М., Федотенков А.Г.
⇐ Перейти на главную страницу сайта ⇐
⇑ Вернуться в начало страницы ⇑
Библиотека Ordo Deus ⇒ ⇒
⇐ Консервирование крови
⇓ Каталог систематический ⇓
Отморожение (В.Э.) ⇒
Внимание! Вы находитесь в библиотеке «Ordo Deus». Все книги в электронном варианте, содержащиеся в библиотеке «Ordo Deus», принадлежат их законным владельцам (авторам, переводчикам, издательствам). Все книги и статьи взяты из открытых источников и размещаются здесь только для чтения.
Библиотека «Ordo Deus» не преследует никакой коммерческой выгоды.
Все авторские права сохраняются за правообладателями. Если Вы являетесь автором данного документа и хотите дополнить его или изменить, уточнить реквизиты автора, опубликовать другие документы или возможно вы не желаете, чтобы какой-то из ваших материалов находился в библиотеке, пожалуйста, свяжитесь с нами по e-mail: info @ ordodeus. ru Формы для прямой связи с нами находятся в нижней части страниц: контакты и устав «Ordo Deus», для перехода на эти страницы воспользуйтесь кнопкой контакты вверху страницы или ссылкой в оглавлении сайта.
Вас категорически не устраивает перспектива безвозвратно исчезнуть из этого мира? Вы желаете прожить ещё одну жизнь? Начать всё заново? Исправить ошибки этой жизни? Осуществить несбывшиеся мечты? Перейдите по ссылке: «главная страница».
