в основе какого метода лежит микроскопическое исследование числа и структуры хромосом в целях

Генетические нарушения у человека и методы их выявления

Генами называются участки ДНК, в которых закодирована структура всех белков в теле человека или любого другого живого организма. В биологии действует правило: «один ген – один белок», то есть в каждом гене содержится информация только об одном определенном белке.

В 1990 году большая группа ученых из разных стран начала проект под названием «Геном человека». Он завершился в 2003 году и помог установить, что человеческий геном содержит 20–25 тысяч генов. Каждый ген представлен двумя копиями, которые кодируют один и тот же белок, но могут немного различаться. Большинство генов одинаковые у всех людей – различается всего 1%.

ДНК находится в клетке внутри ядра. Она особым образом организована в виде хромосом – эти нитеподобные структуры можно рассмотреть в микроскоп с достаточно большим увеличением. Внутри хромосомы ДНК намотана на белки – гистоны. Когда гены неактивны, они расположены очень компактно, а во время считывания генетического материала молекула ДНК расплетается.

В клетках человека есть структуры, которые называются митохондриями. Они выполняют роль «электростанций» и отвечают за дыхание. Это единственные клеточные органеллы, у которых есть собственная ДНК. И в ней тоже могут возникать нарушения.

Весь набор хромосом в клетке называется кариотипом. В норме у человека он представлен 23 парами хромосом, всего их 46. Выделяют два вида хромосом:

Методы исследования хромосом

Для исследования кариотипа применяют специальный метод – световую микроскопию дифференциально окрашенных метафазных хромосом культивированных лимфоцитов периферической крови.

Этот анализ применяется для диагностики различных хромосомных заболеваний. Он позволяет выявлять такие нарушения, как:

Однако с помощью исследования кариотипа можно выявить не все генетические нарушения. Оно не способно обнаружить такие изменения, как:

Для получения дополнительной информации, не видимой в световой микроскоп, используют хромосомный микроматричный анализ (ХМА). С его помощью можно изучить все клинически значимые участки генома и выявить изменения в количестве и структуре хромосом, а именно микрополомки (микроделеции и микродупликации).

Во время хромосомного микроматричного анализа применяют технологию полногеномной амплификации и гибридизации фрагментов опытной ДНК с олигонуклеотидами, нанесенными на микроматрицу. Если объяснять простыми словами, то сначала ДНК, которую необходимо изучить, копируют, чтобы увеличить ее количество, а затем смешивают ее со специальными ДНК-микрочипами, которые помогают выявлять различные нарушения.

Эта методика позволяет в одном исследовании выявлять делеции и дупликации участков ДНК по всему геному. Разрешающая способность стандартного ХМА от 100 000 пар нуклеотидов – «букв» генетического кода (в отдельных регионах от 10 000 п. н.).

С помощью ХМА можно выявлять:

Однако, как и предыдущий метод, хромосомный микроматричный анализ имеет некоторые ограничения. Он не позволяет выявлять или ограничен в выявлении таких аномалий, как:

Мутации в генах и заболевания, к которым они способны приводить

Мутации – это изменения, которые происходят в ДНК как случайным образом, так и под действием разных факторов, например химических веществ, ионизирующих излучений. Они могут затрагивать как отдельные «буквы» генетического кода, так и большие участки генома. Мутации происходят постоянно, и это основной двигатель эволюции. Чаще всего они бывают нейтральными, то есть ни на что не влияют, не приносят ни вреда, ни пользы. В редких случаях встречаются полезные мутации – они дают организму некоторые преимущества. Также встречаются вредные мутации – из-за них нарушается работа важных белков, наоборот, происходят достаточно часто. Генетические изменения, которые происходят более чем у 1% людей, называются полиморфизмами – это нормальная, естественная изменчивость ДНК Полиморфизмы ответственны за множество нормальных отличий между людьми, таких как цвет глаз, волос и группа крови.

Все внешние признаки и особенности работы организма, которые человек получает от родителей, передаются с помощью генов. Это важнейшее свойство всех живых организмов называется наследственностью. В зависимости от того, как проявляются гены в тех или иных признаках, их делят на две большие группы.

Например, карий цвет глаз у человека является доминантным. Поэтому у кареглазых родителей с высокой вероятностью родится кареглазый ребенок. Если у одного из родителей глаза карие, а у другого голубые, то вероятность рождения кареглазых детей в такой семье тоже высока. У двух голубоглазых родителей, скорее всего, все дети тоже будут голубоглазыми. А вот у кареглазых родителей может родиться ребенок с голубыми глазами, если у обоих есть рецессивные «гены голубоглазости», и они достанутся ребенку. Конечно, это упрощенная схема, потому что за цвет глаз отвечает не один, а несколько генов, но на практике эти законы наследования зачастую работают. Аналогичным образом потомству могут передаваться и наследственные заболевания.

Как выявляют рецессивные мутации?

Для выявления мутаций, которые передаются рецессивно, используют целый ряд исследований.

Секвенирование по Сэнгеру – метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов, буквально – «прочтение» генетического кода) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Анализ используется для подтверждения выявленных мутаций. Это лучший метод для идентификации коротких тандемных повторов и секвенирования отдельных генов. Метод может обрабатывать только относительно короткие последовательности ДНК (до 300–1000 пар оснований) одновременно. Однако самым большим недостатком этого метода является большое количество времени, которое требуется для его проведения.

Если неизвестно, какую нужно выявить мутацию, то используют специальные панели.

Панель исследования — тестирование на наличие определенных мутаций, входящих в перечень конкретной панели исследования. Анализ позволяет выявить одномоментно разные мутации, которые могут приводить к генетическим заболеваниям. Анализ позволяет компоновать мутации в панели по частоте встречаемости (скрининговые панели, направленные на выявление носительства патологической мутации, часто встречаемой в данном регионе или в определенной замкнутой популяции) и по поражаемому органу или системе органов (панель «Патология соединительной ткани»). Но и у этого анализа есть ограничения. Анализ не позволяет выявить хромосомные аберрации, мозаицизм и мутации, не включенные в панель, митохондриальные заболевания, а также эпигенетические нарушения.

Не в каждой семье можно отследить все возможные рецессивные заболевания. Тогда на помощь приходит секвенирование экзома – тест для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК путем исследования в одном тесте практически всех областей генома, кодирующих белки, изменения которых являются причиной наследственных болезней.

Секвенирование следующего поколения-NGS – определение последовательности нуклеотидов в геномной ДНК или в совокупности информационных РНК (транскриптоме) путем амплификации (копирования) множества коротких участков генов. Это разнообразие генных фрагментов в итоге покрывает всю совокупность целевых генов или, при необходимости, весь геном.

Анализ позволяет выявить точечные мутации, вставки, делеции, инверсии и перестановки в экзоме. Анализ не позволяет выявить большие перестройки; мутации с изменением числа копий (CNV); мутации, вовлеченные в трехаллельное наследование; мутации митохондриального генома; эпигенетические эффекты; большие тринуклеотидные повторы; рецессивные мутации, связанные с Х-хромосомой, у женщин при заболеваниях, связанных с неравномерной Х-деактивацией, фенокопии и однородительские дисомии, и гены, имеющие близкие по структуре псевдогены, могут не распознаваться.

Что делать, если в семье есть наследственное заболевание?

Существуют два способа выявить наследственные генетические мутации у эмбриона:

Предимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) в цикле ЭКО. Это диагностика генетических заболеваний у эмбриона человека перед имплантацией в слизистую оболочку матки, то есть до начала беременности. Обычно для анализа проводится биопсия одного бластомера (клетки зародыша) у эмбриона на стадии дробления (4–10 бластомеров). Существует несколько видов ПГТ: на хромосомные отклонения, на моногенные заболевания и на структурные хромосомные перестройки. Данные Simon с соавторами (2018) говорят о том, что в случае проведения ЭКО с ПГТ у пациентки 38–40 лет результативность ЭКО составляет 60%. Но при исследовании эмбриона есть ряд ограничений. Так, из-за ограниченного числа клеток можно не определить мозаицизм.

Если нет возможности провести ЭКО с ПГТ, то используют второй вариант – исследование плодного материала во время беременности.

Для забора плодного материала используют инвазивные методы:

Далее эти клетки исследуют при помощи одного или нескольких генетических тестов (которые имеют свои ограничения). Проведение инвазивных методов может быть связано с риском для беременности порядка 1%.

Таким образом, проведя дополнительные исследования, можно значительно снизить риск рождения ребенка с генетическим заболеванием в конкретной семье. Но привести этот риск к нулю на сегодняшний день, к сожалению, невозможно, так как любой генетический тест имеет ряд ограничений, что делает невозможным исключить абсолютно все генетические болезни.

Автор статьи

Пелина Ангелина Георгиевна

Ведёт генетическое обследование доноров Репробанка, осуществляет подбор доноров для пар, имеющих ранее рождённых детей с установленной генетической патологией.

Источник

В основе какого метода лежит микроскопическое исследование числа и структуры хромосом в целях

Цитогенетическое исследование — это микроскопический анализ хромосом, результаты которого весьма важны для постановки диагноза, классификации, лечения и научного исследования заболеваний системы крови, прежде всего — онкогематологических. Значение цитогенетических методов для диагноза и лечения определяется доступностью опухолевых клеток для кариотипирования и их гетерогенностью, а с научной точки зрения — возможностью изучения изменений в структуре и функции генетических локусов, ассоциированных со злокачественной трансформацией.

Морфология хромосом сильно варьирует во время клеточного цикла. Для микроскопического анализа хромосомы должны быть визуализированы как дискретные структуры. Наилучшим образом это достигается на стадии прометафазы митоза, когда каждая хромосома видна как две идентичные хроматиды, и особенно на стадии метафазы, когда хромосомы максимально конденсированы и располагаются в одной плоскости в центре клетки отдельно одна от другой.
Нормальные клетки человека содержат 22 пары аутосом и одну пару половых хромосом: две Х-хромосомы у женщин и по одной копии половых хромосом (X и Y) у мужчин.

Для цитогенетического анализа лейкозов, миелодиспластических синдромов и хронических миелопролиферативных заболеваний исследуют клетки костного мозга. При невозможности их получения может быть исследована кровь (если она содержит бласты). Цитогенетический анализ лимфом выполняется в клетках ткани лимфатического узла. Культивирование клеток из опухоли повышает митотический индекс (пропорцию клеток, находящихся в фазе митоза) и способствует пролиферации злокачественных клеток.

Сравнительное кариотипирование нормальных клеток проводят в Т-лимфоцитах периферической крови, которые предварительно культивируют в среде с митогеном растительного происхождения — фитогемагглютинином.

Окрашивание хромосом в гематологии

В конце 1960-х годов была разработана методология дифференциального окрашивания метафазных хромосом, а в 1971 г. создана номенклатура хромосомных сегментов, позволяющая точно описывать хромосомные аномалии. Позднее были внедрены методики окрашивания менее конденсированных и, соответственно, более длинных профазных и прометафазных хромосом, которые обладают более высоким разрешением, так как позволяют визуализацию 500-2000 сегментов (метафазное окрашивание визуализирует только 300 сегментов).

Достаточно большое количество профазных и прометафазных клеток для анализа получают путем синхронизации клеточного цикла, культивируя клетки в среде, содержащей антиметаболит (например, метотрексат), который ингибирует синтез ДНК. Подавление синтеза ДНК останавливает клеточный цикл в интерфазе. Затем клетки переносят в среду без метотрексата, обогащенную тимидином, где они одновременно входят в фазу митоза. Обработка клеточной культуры колхицином останавливает митоз одновременно во всех клетках на стадии профазы или прометафазы.

Первая стойкая хромосомная аномалия при злокачественной опухоли человека была выявлена в 1960 г. у больных хроническим миелолейкозом и получила название филадельфийской хромосомы (Ph), по имени города, в котором было сделано это открытие. Применение технологии хромосомного окрашивания позволило выявить множество хромосомных аномалий, большая часть которых встречается при онкогематологических заболеваниях. Некоторые красители окрашивают различные участки хромосом с вариабельной интенсивностью в зависимости от структуры хроматина в этих участках, их нуклеотидного и белкового состава.

В результате такого окрашивания получают уникальный паттерн чередования светлых и темных поперечных полос, специфичный для каждой хромосомы.

В настоящее время существуют несколько видов дифференциального окрашивания хромосом. При Q-окрашивании акрихин-ипритом (quinacrine) или акрихиндигидрохлоридом выявляется особый тип флюоресценции каждой хромосомы с образованием Q-исчерченности (Q-banding) — поперечных флюоресцентных полос, называемых Q-полосами (Q.-bands). Это позволяет идентифицировать отдельные хромосомы. Анализ Q-полос выполняют с помощью флюоресцентного микроскопа.

Схема анализа ДНК методом FISH

При окрашивании по Гимзе (G-banding) хромосомы приобретают вид серии темных и светлых полос или бэндов (bands). G-окрашивание применяется чаще, чем Q-окрашивание, так как анализ выполняется с помощью светового микроскопа, а G-полосы, в отличие от Q-полос, не выцветают со временем. Наиболее широко применяется методика, называемая GTG-окрашиванием (G bands by trypsin using Giemsa), с предварительной обработкой трипсином.

R-бэндинг (обработка хромосом горячим спиртовым раствором перед окрашиванием по Гимзе) выявляет полосы, которые обратны G-полосам и называются R-полосами (reverse of G bands).

Помимо Q-, G- и R-окрашивания, позволяющих выявлять полосы вдоль всей длины хромосомы, существуют методики, специализированные для исследования отдельных хромосомных структур, в том числе конститутивного гетерохроматина (С-окрашивание — от англ. constitutive), теломерного района (Т-окрашивание) и района ядрышкового организатора (NOR-окрашивание — от англ. nucleolus organizing region). Размеры и положение С-полос уникальны для каждой хромосомы, но преимущественно они включают центромерныи район и используются при исследовании хромосомных транслокаций, вовлекающих центромерные районы хромосом.

Цитогенетический анализ опухолевых клеток затруднен в связи с неясной морфологией хромосом и слабой различимостью полос. Если в исследование взяты наиболее удобные для анализа метафазные пластинки, образец может быть ошибочно охарактеризован как цитогенетически нормальный.

С развитием методов рекомбинантной ДНК стало возможным использование гибридизации in situ для определения местоположения на хромосомах или в клеточном ядре любой ДНК- и РНК-последовательности. С ее помощью можно изучать и диагностировать онкологические и наследственные генетические болезни. Молекулярная гибридизация in situ является важным инструментом цитогенетических исследований, позволяет выявлять хромосомные перестройки, идентифицировать маркерные хромосомы, проводить быстрое кариотипирование клеточных линий. Важно, что подобный анализ можно проводить не только на метафазных хромосомах, но и на интерфазных ядрах.

Разрешающая способность «интерфазной цитогенетики» на два порядка выше, чем классической цитогенетики.

Несмотря на многоцелевое использование молекулярной гибридизации ДНК-ДНК (РНК) in situ, все модификации метода выполняются в соответствии с общими принципами. Существуют несколько вариантов, которые включают в себя несколько этапов: подготовка и мечение ДНК (РНК)-зонда, приготовление препаратов хромосом, собственно гибридизация, детекция гибридных молекул.

В 1980-х годах цитогенетическая методология обогатилась молекулярно-цитогенетическим методом, называемым флюоресцентной гибридизацией in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), который вскоре стал наиболее популярным. Суть этого метода заключается в гибридизации ДНК-зондов к специфическим последовательностям ДНК, меченных флюорохромами, с метафазными или интерфазными хромосомами, которые визуализируются флюоресцентной микроскопией. Определение нуклеотидной последовательности методом FISH выполняется непрямым способом, путем гибридизации синтетического олигонуклеотида (зонда) с анализируемой ДНК (называемой также матричной ДНК или ДНК-мишенью).

Если зонд синтезирован с включением флюоресцентных или антигенных молекул, которые распознаются флюоресцирующими антителами, становится возможной визуализация относительного положения зонда на анализируемой ДНК.

Флюорохром может быть связан с ДНК ковалентно (прямое мечение) или посредством иммуноцитохимических реакций, когда ДНК-зонд метят гаптеном (биотин, дигоксигенин), а флюорохром связан с алкалоидом авидином (стрептавидином), обладающим сильным сродством к биотину (или с антителами против биотина или дигоксигенина). При использовании гаптенов возможна амплификация флюоресцентного сигнала с помощью биотинилированных антител к авидину и вторичных антител, специфичных предыдущему слою антител и окрашенных флюорохромом.

Для амплификации флюоресцентного сигнала применяется метод «иммунных сэндвичей». Например, на препарат, изображенный на схеме, наносят биотинилированные антитела к авидину, а затем снова комплекс авидин-флюоресцеин. При необходимости цикл может быть повторен. Антитела в свою очередь выявляются с помощью ферментативного (например, авидинпероксидазы) или флюоресцентного детектора.

Метод FISH предназначен для выявления:
1) гибридных клеток;
2) транслокаций и других, в том числе числовых, хромосомных аномалий;
3) меченых хромосом в интерфазных и метафазных клетках.

Высококонтрастная флюоресцентная гибридизация достигается благодаря использованию флюоресцентных красителей разного цвета. С помощью двуцветной FISH выявляются тонкие структурные аномалии, например хромосомные транслокации, в том числе и неразличимые при дифференциальном окрашивании.

В настоящее время возможно выполнение многоцветной гибридизации in situ для одновременного окрашивания всех хромосом в сложном кариотипе с множественными числовыми и структурными аномалиями. Комбинация разных модифицирующих агентов и флюорохромных красителей позволяет одновременно выявлять несколько последовательностей ДНК в одном ядре (флюоресцеин дает зеленую флюоресценцию, техасский красный и родамин — красную, гидроксикумарин — голубую и т. д.). Сочетание пяти флюорохромов в разных пропорциях и компьютерный анализ изображений позволяет одновременно окрасить разным цветом все хромосомы и визуализировать 27 различных ДНК-зондов, которые служат уникальной меткой для каждой хромосомы. Эта методика называется многоцветной FISH (multicolor, или multiplex, fluorescence in situ hybridization, M-FISH).

Значение цитогенетических методов неодинаково при разных онкогематологических заболеваниях. Миелоидные клетки обычно легко кариотипируются при дифференциальном окрашивании, и FISH лишь подтверждает результаты рутинной цитогенетики. Лимфоидные клетки у больных хроническим лимфолейкозом и, особенно, множественной миеломой кариотипировать значительно сложнее из-за низкого уровня пролиферации (даже при использовании В-клеточных митогенов). В этом случае FISH демонстрирует в несколько раз большую частоту анеуплоидии, чем обычные цитогенетические методики.

Клиническое значение цитогенетических исследований

Диагноз. Потомство клетки с приобретенной цитогенетической аномалией может иметь пролиферативное преимущество и давать начало клону — клеточной популяции, происходящей от одной клетки-предшественницы. Обнаружение клональных хромосомных аномалий способствует постановке диагноза клонального поражения костного мозга. Например, цитогенетический анализ позволяет установить диагноз миелодиспластического синдрома у пациентов с умеренной цитопенией или при наличии в аспирате костного мозга минимально выраженных качественных нарушений гемопоэза.

Присутствие специфических хромосомных аномалий помогает выделить подгруппы пациентов, которым требуется специфическая терапия. Например, транслокация t(15;17)(q22;qll-21) подтверждает диагноз острого промиелоцитарного лейкоза (ОМЛ — МЗ), в комплексном лечении которого используется ретиноевая кислота.

Прогноз. Результаты цитогенетического анализа имеют не только диагностическое, но и прогностическое значение. Например, обнаружение множественных хромосомных аномалий у больных острыми лейкозами до начала лечения является прогностически неблагоприятным и служит основанием для выполнения трансплантации костного мозга или стволовых клеток периферической крови в первой полной ремиссии.

Контроль результатов лечения. Цитогенетический анализ костного мозга пациентов после проведенного лечения помогает контролировать степень элиминации опухолевого клона и, следовательно, полноту ремиссии. Выявление хромосомных аномалий, характерных для опухолевых клеток данного пациента, является ранним признаком, свидетельствующим о приближающемся рецидиве.

Цитогенетический анализ имеет большое значение в диагностике и лечении гематологических заболеваний, которое все возрастает по мере совершенствования методологии и накопления знаний об этиологической и патогенетической роли хромосомных аномалий в развитии этих болезней.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Источник

В основе какого метода лежит микроскопическое исследование числа и структуры хромосом в целях

Рассмотрите таблицу «Методы биологических исследований» и заполните пустую ячейку, вписав соответствующий термин.

Гибридологический — генетический анализ потомства (гибридов), полученного от родителей, отличающихся по одному или нескольким признакам.

Цитогенетический — изучение количества и структуры хромосом с помощью микроскопа, позволяет выявить хромосомные (изменение структуры хромосом) и геномные (изменение количества хромосом) мутации.

Близнецовый — метод сравнительного изучения наследования признаков у близнецов, позволяет установить роль среды и наследственности в определении признака.

Генеалогический — изучение наследование признака на основе анализа родословных, позволяет определять характер наследования признака, а также особенности наследования признаков, обусловленных генными мутациями.

Популяционно-статистический — определение частоты встречаемости различных генов в популяциях организмов.

Число хромосом в кариотипе определяют цитогенетическим методом. В качестве правильного ответа также может подойти цитологический метод, как более общий метод любых исследований клеток и тканей с помощью светового микроскопа, и который включает в себя цитогенетический метод.

Ответ: цитогенетический, ИЛИ цитологический.

Источник