жидкость для консервации органов

Консервирующая жидкость для биологических объектов

Владельцы патента RU 2367155:

Изобретение относится к области медицины, а именно к анатомии.

Задачей изобретения является удешевление процесса консервирования биологических объектов для широкого применения при проведении научных исследований и в учебной работе.

Это достигается за счет того, что консервант содержит следующее соотношение компонентов (мас.%):

Предложенный консервант может быть легко приготовлен в условиях анатомических кафедр ВУЗов, достаточно дешев (15-20 рублей за 1 литр), не токсичен. Консервант (прототип) стоит 600-1300 рублей за литр. Этилацетат и бензойная кислота являются антисептическими компонентами. Этиленгликоль обладает гигроскопическими свойствами, препятствует испарению влаги. Цинка хлорид обладает противогрибковыми и антисептическими свойствами. Соотношение ингредиентов подобрано экспериментально и является наиболее оптимальным, так как обеспечивает сохранение свойств объекта: эластичность, цвет, объем.

Способ осуществляется следующим образом:

отдельные органы и/или части тела трупа консервируют путем погружения в 10-кратный объем консерванта сроком на 1-7 дней в зависимости от размеров консервируемого объекта, возможна дополнительная перфузия консерванта в сосудистое русло или непосредственно в ткани при больших размерах объекта с последующим обертыванием трупа смоченной в консерванте простыней и хранением в полиэтиленовом мешке.

Длительность данной процедуры составляет 3 дня. Фиксированный образец подлежит дальнейшему сохранению в герметичных пакетах или других герметичных емкостях, заполненных жидкостью вышеуказанного состава. Получены следующие результаты: цвет объекта сохранен частично, консистенция объекта упруго-эластичная, форма, объем и масса сохранены полностью, что удовлетворяет практическим требованиям.

с последующим погружением его в 10-кратный объем аналогичного консерванта. Длительность данной процедуры составляет 7 дней. Фиксированный образец подлежит дальнейшему сохранению в герметичных пакетах или других герметичных емкостях, заполненных жидкостью вышеуказанного состава. Получены следующие результаты: цвет объекта сохранен частично, консистенция объекта упруго-эластичная, форма, объем и масса сохранены полностью, что удовлетворяет практическим требованиям.

с предварительной промывкой и дренажем корпоральных жидкостей по общепринятой схеме, и нагнетания шприцом аналогичного консерванта непосредственно в ткани органа, с последующим обертыванием конечности простыней, смоченной в жидкости вышеуказанного состава. Фиксированный образец подлежит дальнейшему хранению в герметичных полиэтиленовых пакетах. Получены следующие результаты: цвет объекта сохранен частично, консистенция объекта упруго-эластичная, форма, объем и масса сохранены полностью, что удовлетворяет практическим требованиям.

Консервант для биологических объектов, представляющий собой водный раствор, отличающийся тем, что консервант содержит следующее соотношение компонентов (мас.%):

Источник

Консервант для анатомических препаратов

Владельцы патента RU 2591982:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при изготовлении макроскопических препаратов и бальзамировании трупов. Консервант анатомических препаратов для фиксации биологических тканей представляет собой 1-10%-ный водный раствора бензоата натрия. Изобретение позволяет улучшить качество, информативность и эстетичность анатомических препаратов. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к нормальной и патологической анатомии, зоологии, эмбриологии и может быть использовано при изготовлении макроскопических препаратов для научных и учебных целей, а также для бальзамирования трупов.

Всех этих недостатков лишены препараты, изготовленные с помощью пластинации. Однако этот метод сложен, требует наличия специального дорогостоящего оборудования и реактивов, что препятствует его массовому применению. К тому же этот метод не исключает предварительной фиксации препарата формалином.

Наиболее близким аналогом предлагаемого консерванта, является водный раствор этилацетата, бензойной кислоты, хлорида цинка и этиленгликоля (Колесник Л.Л., Харибова Е.А., Нечай В.В. Консервирующая жидкость для биологических объектов. // Патент РФ на изобретение №2367155. Опубл. 20.09.2009). Данная консервирующая жидкость выбрана прототипом.

Изобретение направлено на улучшение качества, повышение информативности и эстетичности анатомических препаратов за счет предупреждения изменений их естественной окраски, консистенции и размеров, увеличения срока службы и устранения факторов профессиональной вредности персонала анатомических и патологоанатомических лабораторий, обусловленных применением токсичных консервирующих смесей, осуществляемые посредством замены консерванта, используемого для изготовления и хранения анатомических и патологоанатомических макропрепаратов. Также в задачи изобретения входит замещение импорта консервирующих жидкостей, упрощение и удешевление процесса консервирования биологических объектов. Это достигается путем применения в качестве консерванта анатомических препаратов водного раствора бензоата натрия.

Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется примерами, рассмотренными ниже.

Для экспериментальной проверки предлагаемого вещества был приготовлен 1% раствор бензоата натрия, в который помещали фиксируемые анатомические макропрепараты (сердце, почка человека). Обследование проводили в разные сроки.

Анатомические препараты, фиксированные 1% раствором бензоата натрия, имеют близкую к естественной окраске, не уменьшаются в объеме, сохраняют естественную консистенцию (упруги и эластичны), длительно хранятся в водном растворе бензоата натрия.

При консервации заявленным способом отмечается слабое изменение естественной окраски органа как на внешней поверхности, так и на разрезе. Прогрессирующего обесцвечивания не наблюдается.

Таким образом, заявленный консервант незначительно изменяет окраску органа.

Для оценки изменения консистенции и размеров анатомических препаратов были измерены объем и масса анатомических препаратов до и после заявленным способом.

При консервации препаратов по заявленному способу исходные показатели объема и массы существенно не изменялись. Следовательно, заявленный консервант не изменяет консистенцию и размеры анатомических препаратов.

При изучении сохранности препаратов, консервированных по заявленному способу, установлено, что у препаратов, фиксированных раствором заявленного консерванта, не обнаруживается признаков развития сапрофитной микрофлоры в течение 2-3 лет.

Важным фактором профессиональной вредности для работников анатомических и патологоанатомических лабораторий являются консервирующие жидкости, в состав которых входят токсичные и летучие соединения, обладающие выраженным местнораздражающим и токсическим действием. Длительный контакт с их парами приводит к снижению мукоцилиарного клиренса за счет гибели клеток реснитчатого эпителия дыхательных путей и снижения выработки сурфактанта, что способствует развитию и хронизации инфекционной патологии верхних дыхательных путей. Растворы бензоата натрия не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку дыхательных путей, не летучи, вследствие чего не вызывают поражения органов дыхания. Данный консервант малотоксичен, вследствие чего даже при длительном контакте с предлагаемым раствором практически исключаются ситуации, сопровождающиеся нежелательными последствиями для здоровья человека. Он имеет относительно небольшую стоимость и в достаточном количестве производится на территории Российской Федерации.

Консервант для анатомических препаратов на основе дезинфицирующего средства, отличающийся тем, что в качестве консерванта анатомических препаратов используется 1-10% водный раствор бензоата натрия.

Источник

Два направления консервации органов для трансплантации

Сейчас в России проводятся порядка 2 тыс. трансплантаций органов ежегодно. Ограничения на число трансплантаций накладывают как общая нехватка органов из-за отсутствия доноров, так и малая длительность хранения трансплантатов, ограничивающая их транспортировку.

Используемый в клинической практике метод сохранения донорских органов — статическая холодовая консервация — обеспечивает жизнеспособность трансплантатов при сроках консервации, не превышающих 24 часа для почки, 12 часов для печени и 6 часов для сердца. При таких сроках хранения — особенно сердца — становится крайне затруднена логистика донорских органов.

Пролонгация хранения органов существенно улучшила бы ситуацию с доступностью пересадок за счет более эффективной логистики, а разработка технологии долговременного — например, месячного — хранения в перспективе способствовала бы ликвидации дефицита донорских органов за счет создания соответствующих криобанков.

Сегодня хранение органов стандартно осуществляется в специальном консервирующем растворе в гипотермических условиях при 4°С (статическая холодовая консервация).

Рассматривая же проблему долговременного хранения органов, необходимо говорить о низкотемпературном замораживании, а не о гипотермии. Скорость протекания химических реакций экспоненциально падает с понижением температуры, и чтобы остановить метаболизм на требуемый месяц, необходимо глубокое охлаждение, до –70°С и ниже. Для макрообъектов, таких как массивы тканей и целые органы, проблема глубокого охлаждения не решена.

Таким образом, можно выделить два основных направления развития технологий консервации органов: разработка новых подходов к пролонгации гипотермического хранения и разработка способа низкотемпературного замораживания для долговременного хранения.

По первому направлению в Институте биофизики клетки РАН (Пущино) проведены исследования по консервации сердца в газовых смесях различного состава при 4°С и подобраны варианты сочетанного воздействия давления смеси газов на основе монооксида углерода и органопротекторных фармакологических субстанций, обеспечивающобеспечивающие эффективное восстановление активности изолированного сердца крыс после 24 и более часов гипотермического хранения. Высокая сохранность трансплантата показана в серии гистологических анализов, а приживляемость подтверждена на модели гетеротопической пересадки сердца крысы.

Также впервые газовая консервация успешно использована для сердца мини-свиньи (вес животных — 35 кг). Достигнуто восстановление сократительной активности после 20-часового хранения при температуре 4°С как на перфузионном стенде, так и на модели гетеротопической пересадки.

Предложенный подход по нескольким критериям превосходит активно разрабатываемые сегодня в мире системы для перфузионного хранения органов, основанные на нормотермической перфузии с оксигенацией кровью, когда донорский орган сохраняется в условиях, близких к физиологическим.

По второму направлению — низкотемпературному замораживанию органов — наиболее перспективным представляется перевод внутриклеточной воды в стекловидное состояние (витрификация), когда не образуется отдельных кристаллов льда — ключевого повреждающего фактора при глубоком охлаждении.

На практике витрификация требует высоких концентраций (до 70 весовых процентов) проникающих низкомолекулярных агентов (этиленгликоль, ДМСО), для того чтобы повысить вязкость среды и достичь критической температуры стеклования. Но такие концентрации оказывают токсический эффект на живые клетки.

В институте разработана и экспериментально обоснована на клеточной, тканевой и органной моделях концепция витрификации биологических объектов, обеспечивающая замораживание без кристаллизации в условиях сниженной на 20–30% суммарной концентрации витрифицирующих агентов. С ее помощью осуществлена успешная криоконсервация клеточных суспензий, аорты крысы, а также изолированного органа — сердца травяной лягушки (Ranatemporaria). Хранение сердца осуществляли при температурах –130°С и –196°С в течение времени, варьировавшегося от одних суток до полутора месяцев, с последующим восстановлением сократительной активности на перфузионном стенде.

Владимир Тесленко, кандидат химических наук; по материалам VI съезда биофизиков России

Владимир Тесленко, кандидат химических наук; по материалам VI съезда биофизиков России

Источник

Заготовка, консервирование и хранение органов и тканей

ТРАНСПЛАНТОЛОГИЯ

В зависимости от анатомической зоны, в которую помещают трансплантат выделяют ОРТОТОПИЧЕСКУЮ трансплантацию (орган помещают на свое анатомическое место) и ГЕТЕРОТОПИЧЕСКУЮ трансплантацию (орган перемещают в иное, не предназначенное ему природой место).

Помимо пересадки органов, в трансплантологии последних лет появилось новое перспективное направление клеточной трансплантации, когда с целью восстановления функции в организм реципиента пересаживаются культивированные клетки органа.

Источником тканей и органов для трансплантации являются практически здоровые люди погибшие от случайных причин (тяжелых травм не совместимых с жизнью) или скончавшиеся в результате остро развившихся тяжелых заболеваний (инфаркт миокарда, инсульт и т.п.). Наиболее оптимальным для трансплантологии источником являются близкие родственники пациента нуждающегося в пересадке органа или тканей. Это обусловлено тем, что при изогенной или сингенной трансплантации реакция тканевой несовместимости выражена мало и наступает достаточно быстрое выздоровление реципиента. Однако изогенная и сингенная трансплантация возможна только парных органов.

Другим, не менее важным источником для трансплантологии являются ткани трупа (кожа, сухожилия, кости, роговица и т.д.).

Несколько реже в качестве источника тканей для трансплантации используют животных.

Медицинским противопоказанием к изъятию тканей и органов для трансплантации являются все случаи смерти от инфекционных заболеваний, острых и хронических отравлений, злокачественных опухолей, туберкулеза, а также случаи смерти ВИЧ инфицированных пациентов и больных СПИД.

Важным моментом заготовки органов и тканей для аллотрансплантации являются не только медицинские, но и морально-этические и юридические аспекты. Забор органов и тканей должен производится с согласия родственников, после констатации врачебной комиссией смерти мозга потенциального донора. В состав этой комиссии входят: анестезиолог; хирург или нейрохирург; невропатолог; психиатр; лечащий врач. Критерием установления диагноза смерти мозга служат: 1.Глубокая безрефлекторная кома; 2.Отсутствие кашлевого рефлекса при эндотрахеальном отсасывании; 3.Полный центральный паралич дыхания; 4.Изоэлектрическая (нулевая линия) при электроэнцефалографии; 5.Интракраниальная остановка кровообращения (доказанная с помощью ангиографии). Констатация смерти мозга комиссией осуществляется в письменном виде с подписями всех ее членов.

Забор, консервирование и хранение органов и тканей для трансплантации производят при строгом соблюдении правил асептики и антисептики в специально оборудованных лабораториях-операционных центров трансплантологии, НИИ и их филиалов. Изъятие органов у донора выполняют сразу же после констатации комиссией смерти мозга, на фоне внутривенных вливаний донору растворов электролитов, диуретиков, ангиопротекторов, а также при проведении искусственной вентиляции легких. Эти мероприятия имеют цель сохранить функции донорских органов до конца операции их изьятия. не рекомендуется выполнять забор органов в период тепловой ишемии (период времени, когда циркуляция крови уже прекращена, а температура тканей еще близка к нормальной).

Ткани трупа изымают и консервируют в первые 6 часов после смерти. Консервирование тканей трупа возможно в течение первых суток при условии хранения их в специальных условиях при температуре 0 0 С.

После изъятия органы и ткани вначале тщательно отмывают от крови и тканевой жидкости в специальных растворах, а затем, в зависимости от предполагаемой длительности хранения, приступают к консервированию.

Существуют следующие методы консервирования тканей и органов:

2. Консервирование в специальных растворах, содержащих антибиотики или антисептики, с последующим хранением в плазме или крови реципиента или охлажденном растворе;

4. Консервирование в парафине;

5. Консервирование в растворе альдегида (глютаральдегид, формальдегид).

После консервирования материал хранят в специальных условиях в центрах и НИИ трансплантологии, создавая таким образом банк органов и тканей. Доставка органов для трансплантации в хирургические клиники и отделения осуществляется в специальных контейнерах в растворе при температуре +4 0 С.

Источник

Водный раствор для консервации тканей и органов

Владельцы патента RU 2479999:

Изобретение относится к медицине. Водный раствор для консервации тканей и органов включает эффективное количество карведилола, эффективное количество такролимуса и эффективное количество триметазидина. Ткани и органы хранят в растворе при температуре 2-10°С. Изобретение позволяет повысить степень защиты органов и тканей. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 10 ил., 6 табл.

Настоящее изобретение относится к водному раствору для консервации тканей и органов, его использованию, в частности для консервации маргинальных органов, и способу консервации тканей и органов.

Пересадка органов является предпочтительным способом лечения для пациентов с конечной стадией хронических заболеваний. Несмотря на успехи в улучшении методов пересадки, повреждение трансплантата, происходящее в течение ишемического периода и последующей реперфузии, все еще остается нерешенной проблемой в клинической практике.

После забора у донора и до пересадки реципиенту орган(ы) и ткани подвергаются неизбежному периоду ишемии. Поэтому жидкие растворы, используемые для консервации органов и тканей, должны отвечать некоторым требованиям: удалять кровь донора, быстро охлаждать орган и обеспечивать эффективную консервацию и защиту от вызванных ишемией повреждений.

Статическая низкотемпературная консервация является эффективным способом консервации органа в течение коротких периодов ишемии. Однако длительные периоды ишемии связаны с первичным отсутствием функции у трансплантата при пересадке печени и нарушением функции трансплантата при пересадке почки. Кроме потребности в продлении периода ишемии, ограниченное число доноров и связанное с этим увеличение числа пациентов, ожидающих пересадки органов, привело к одобрению использования маргинальных органов, которые плохо переносят повреждения, вызываемые длительной ишемией. В случае пересадки печени использование маргинальных органов, таких как стеатозные трансплантаты, связано с увеличенным по сравнению с нестеатозными трансплантатами риском первичного отсутствия функции или нарушения функции у трансплантата после пересадки. Кроме того, печень с некоторыми типами стеатоза считается непригодной для пересадки, что увеличивает дефицит органов для пересадки. Хорошо известно, что большинство повреждений, обнаруживаемых в маргинальных органах во время пересадки, связано с периодом низкотемпературной консервации. Эти наблюдения указывают на то, что консервация органов должна быть оптимизирована. Поэтому основной целью консервации органов является попытка увеличить время, в течение которого они переносят ишемию.

Такролимус (TCR) является химическим соединением из группы макролидов, обладающим иммунодепрессивной, антимикробной и другими видами фармакологической активности, он применяется для предотвращения реакций отторжения при пересадке органов и тканей, а также при лечении аутоиммунных и инфекционных заболеваний. Известно, что введение этого вещества в консервирующие растворы способно защитить от реперфузионного повреждения. Консервирующий раствор UW, содержащий такролимус, был описан в литературе (K.G. Rajesh et al., “Mitochondrial Permeability transition-pore inhibition enhances functional recovery after long-time hypothermic heart preservation”, Transplantation, 2003, vol. 76(9), pp. 1314-20). Его действие было испытано при консервации сердец. Тем не менее было сделано заключение о том, что такролимус не оказывает никакого влияния на процесс консервации.

Карведилол (CVD) является липофильным неселективным β-адреноблокатором, обладающим сосудорасширяющим действием, осуществляемым главным образом за счет избирательной блокады α1 рецепторов, и сильным антиоксидантным действием. Карведилол обладает значительно большей способностью ингибировать перекисное окисление липидов, чем другие протестированные β-адреноблокаторы, что может объяснять его превосходное защитное действие в моделях ишемии/реперфузии. Несмотря на то, что добавление антиоксидантов, таких как карведилол, в консервирующие растворы рекомендуется в литературе (см. B. Yard et al., “Prevention of cold-preservation injury of cultured endothelial cells by catecholamines and related compounds”, American Journal of transplantation, 2004, vol. 4, pp. 22-30), никаких конкретных консервирующих растворов, содержащих карведилол, до сих пор не было раскрыто.

В недавней работе указывается на то, что добавление триметазидина (TMZ) в консервирующий раствор UW улучшало способность стандартного консервирующего раствора защищать как нестеатозную, так и в особенности стеатозную печень, подвергнутую длительному ишемическому периоду (см. I. Ben Mosbah et al., “Trimetazidine: Is it a promising drug for use in steatotic grafts?”, World J Gastroenterol, 2006, vol. 12(6), pp. 908-914).

Тем не менее некоторые из свойств раствора UW, такие как высокая концентрация калия (необходимая для промывки органа перед реперфузией трансплантата в теле реципиента) и наличие гидроксиэтилкрахмала (ГЭК) для поддержания онкотического давления (который возможно ответственен за агрегацию эритроцитов) не способствуют сохранению органов. Недавние исследования показали, что трансплантаты печени (как стеатозные, так и нестеатозные трансплантаты) лучше сохраняются в модифицированном консервирующем растворе UW (названном IGL-1), который от оригинального раствора UW отличается взаимным изменением значений концентраций K + и Na + и заменой ГЭК полиэтиленгликолем (ПЭГ) (см. I. Ben Mosbah et al., “Preservation of steatotic livers in IGL-1 solution”, Liver Transpl, 2006, vol. 12(8), pp. 1215-23). С другой стороны, несмотря на улучшения, обеспечиваемые раствором IGL-1, отрицательное влияние ишемии-реперфузии остается неустраненным.

Таким образом, все еще существует потребность в создании консервирующих растворов, позволяющих увеличить время, в течение которого орган переносит ишемию, и минимизировать неизбежный риск, связанный с пересадкой маргинальных органов.

Несмотря на то, что консервирующие растворы, содержащие такролимус, карведилол или триметазидин, или известны, или предполагаются из уровня техники, водный раствор для консервации тканей и органов, содержащий комбинацию этих трех активных фармацевтических ингредиентов никогда не был предложен. Авторами изобретения было неожиданно обнаружено, что консервирующий раствор, содержащий комбинацию такролимуса, карведилола и триметазидина, синергически улучшает сохраняемость тканей и органов в течение длительного ишемического периода. В частности, синергический эффект особенно заметен в случае маргинальных органов, таких как стеатозная печень, что делает этот раствор особенно полезным, так как он, по-видимому, способен улучшать исходное состояние маргинальных органов, пригодных для пересадки, но обладающих неполноценной послеоперационной функциональностью, и также может увеличить использование органов, которые сегодня считаются непригодными для пересадки, и тем самым увеличить количество органов, пригодных для пересадки.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к водному консервирующему раствору для консервации тканей и органов, содержащему эффективное количество карведилола, эффективное количество такролимуса и эффективное количество триметазидина.

Водный консервирующий раствор настоящего изобретения делает возможным сохранение тканей и органов в течение периода времени более длительного, чем тот, который достигается другими известными консервирующими растворами. Другим преимуществом консервирующего раствора настоящего изобретения является то, что он делает возможным продление периода времени, в течение которого ткань или орган функционируют должным образом, и в течение которого они могут быть использованы для пересадки, по сравнению с тем периодом, который может быть достигнут при использовании других консервирующих растворов.

В другом аспекте данное изобретение относится к применению водного раствора настоящего изобретения для консервации тканей или органов. Этот раствор может быть применен для консервации тканей или органов млекопитающих, включая человека. Примерами указанных тканей являются вены и артерии.

Также частью данного изобретения является способ консервации тканей и органов, включающий сохранение указанных тканей или органов в водном растворе настоящего изобретения при температуре от 2°С до 10°С. Реперфузионное повреждение, связанное с приживлением ткани или органа и отторжением трансплантата, предотвращается путем погружения ткани или органа в водный консервирующий раствор настоящего изобретения.

Используемый в настоящем изобретении термин «эффективная концентрация» активного ингредиента обозначает количество активного ингредиента, которое обеспечивает консервацию тканей или органов.

Любой приведенный здесь диапазон значений может быть расширен или изменен без потери желаемого эффекта, как это будет очевидно для специалиста в данной области техники. Таким образом, данные диапазоны значений, например концентраций и тому подобного, следует рассматривать как приблизительные, если специально не указано иное.

На протяжении текста описания и формулы изобретения термин «включать» и его производные не предполагают исключение других технических характеристик, добавок, компонентов или стадий.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1-10 показано влияние добавления такролимуса (TCR), карведилола (CVD) и триметазидина (TMZ) к некоторым известным консервирующим растворам и действие консервирующего раствора Примера 1 (P1) на стеатозную (С) и нестеатозную (НС) печень, подвергнутую длительному ишемическому периоду. Числа %P означают процент защиты.

На Фиг.1 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором UW, когда количество АЛТ оценивалось в конце ишемического периода (0 мин).

На Фиг.2 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором UW, когда количество АЛТ оценивалось в конце реперфузии (120 мин).

На Фиг.3 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором UW, когда уровень выработки желчи оценивался в конце реперфузии (120 мин).

На Фиг.4 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором UW, когда печеночный клиренс, выраженный в виде % БСФ в желчи, оценивался во время реперфузии.

На Фиг.5 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором UW, когда уровень АТФ оценивался в конце реперфузии (120 мин).

На Фиг.6 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором IGL-1, когда количество АЛТ оценивалось в конце ишемического периода (0 мин).

На Фиг.7 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором IGL-1, когда количество АЛТ оценивалось в конце реперфузии (120 мин).

На Фиг.8 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором IGL-1, когда уровень выработки желчи оценивался в конце реперфузии (120 мин).

На Фиг.9 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором IGL-1, когда печеночный клиренс, выраженный в виде % БСФ в желчи, оценивался во время реперфузии.

На Фиг.10 показан процент защиты по сравнению с консервирующим раствором IGL-1, когда уровень АТФ оценивался в конце реперфузии (120 мин).

Подробное описание изобретения

Водный раствор настоящего изобретения может быть применен к тканям или органам во время их забора у донора и во время их хранения, транспортировки и последующей пересадки реципиенту. Он может быть использован для короткого и преимущественно для длительного ишемического периода.

В предпочтительном варианте осуществления водный раствор настоящего изобретения содержит карведилол в концентрации от 5 до 10 мкМ, такролимус в концентрации от 5 до 10 мкМ и триметазидин в концентрации от 0,01 мкМ до 10 мкМ.

Для того чтобы избежать образования клеточного или тканевого отека, водный раствор настоящего изобретения включает в себя полиэтиленгликоль (ПЭГ), имеющий молекулярную массу более 15000, который позволяет обеспечить онкотическое давление. Предпочтительно, используемый ПЭГ имеет молекулярную массу 35000. Более предпочтительно, ПЭГ представляет собой нелинейный очищенный ПЭГ, а именно ПЭГ, синтезированный из молекул ПЭГ с низкой молекулярной массой.

Хорошо известно, что основной причиной, по которой органы признаются непригодными для пересадки, является стеатоз. Вышеуказанные предпочтительные варианты осуществления консервирующего раствора настоящего изобретения позволяют повысить устойчивость стеатозной печени к ишемическому-реперфузионному повреждению, связанному с пересадкой печени. Этот факт позволяет улучшить посттрансплантационное функционирование стеатозного трансплантата и увеличить количество органов пригодных для пересадки.

Особенно предпочтительный водный раствор настоящего изобретения состоит из следующих компонентов:

— полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу примерно 35000, в концентрации 0,03 мМ,

— раффиноза в концентрации 30 мМ,

— MgSO₄ в концентрации 5 мМ,

— ионы калия в концентрации 40 мМ,

— ионы натрия в концентрации 120 мМ,

— лактобионовая кислота в концентрации 100 мМ,

— такролимус в концентрации 5 мкМ,

— карведилол в концентрации 10 мкМ,

— триметазидин в концентрации 1 мкМ,

и имеет рН 7,4 и осмоляльность 320 мМ/кг.

Более предпочтительно, этот консервирующий раствор также включает в себя дексаметазон в концентрации 16 г/л и пенициллин в концентрации 200000 ед./л.

В этих двух предпочтительных вариантах осуществления консервирующий раствор настоящего изобретения не содержит определенных медикаментов, таких как глутатион (GSH), ГЭК, инсулин, аллопуринол и аденозин, которые входят в состав уже известных консервирующих растворов (таких как консервирующие растворы UW и/или IGL-1) и которые, как было показано, являются неэффективными или даже оказывают отрицательное воздействие на консервируемый орган. Особенно значительное взаимное усиление действия было отмечено для этих трех предпочтительных консервирующих растворов, так как они обеспечивают защиту как стеатозной, так и нестеатозной печени, по сравнению с результатами, полученными для других консервирующих растворов.

Консервирующий раствор настоящего изобретения применяется для статической низкотемпературной консервации и используется при температуре от 2°С до 10°С, предпочтительно от 3°С до 5°С, и более предпочтительно при 4°С.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает все возможные комбинации частных и предпочтительных групп, описанных выше.

Дополнительные цели, преимущества и отличительные признаки настоящего изобретения станут очевидны специалисту в данной области техники частично из описания и частично из осуществления изобретения. Следующие примеры и рисунки приводятся в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Пример 1: Приготовление водного консервирующего раствора

Водный раствор, чей состав приведен в Таблице 1, был приготовлен в соответствии с описанным ниже процессом.

К раствору, содержащему 1 г диализированного полиэтиленгликоля (ПЭГ 35000), добавляли 4,11 мг такролимуса (TCR) и перемешивали до образования первого раствора.

В емкость объемом один литр, содержащую 800 мл дистиллированной и деионизированной воды комнатной температуры, добавляли 35,83 г лактобионовой кислоты и перемешивали до растворения. Затем добавляли 0,60 г MgSO₄, 22,5 мл 5Н NaOH, 6 мл 5Н KOH, 3,4 г KH₂PO₄ и 17,83 г раффинозы для получения второго раствора. Далее в этот второй раствор добавляли 1 мл исходного раствора TMZ (исходный раствор: 2,66 мг TMZ, растворенного в 10 мл воды) и 10 мл исходного раствора CVD (исходный раствор: 6,5 мг карведилола в 8 мл винной кислоты и 8 мл воды).

Раствор, приготовленный на стадии 1, смешивали с раствором, приготовленным на стадии 2, после чего при необходимости добавляли 5Н NaOH для того, чтобы довести значение pH до 7,4±0,1.

В довершение всего в емкость добавляли воду, чтобы довести объем до литра, после чего раствор фильтровали и стерилизовали. Раствор, имеющий осмолярность 320±10 мосм/л, был получен, перед использованием в него добавляли дексаметазон (16 г/л) и пенициллин (200000 ед./л).

В этом примере сравнивается влияние на печень водного раствора настоящего изобретения по отношению к результатам, полученным при использовании консервирующих растворов UW и IGL-1.

Повреждение и функционирование печени оценивали путем измерения уровня трансаминаз, выработки желчи, печеночного клиренса (% БСФ) и содержания АТФ.

Для выполнения исследования были использованы гомозиготные (тучные, Ob) и гетерозиготные (худые, Ln) крысы Цукера в возрасте 16-18 недель, приобретенные у фирмы «Иффа-Кредо» (Iffa-Credo, L’Abresle, France). Изолированная перфузируемая печень была использована для того, чтобы при оценке повреждения и функционирования печени избежать влияния других органов, компонентов плазмы и нейронально/гормональных эффектов. Архитектура печени, микроциркуляция и выработка желчи сохраняются в этой экспериментальной модели. Данная экспериментальная модель часто рассматривается в литературе, в качестве предназначенной для испытания эффективности различных консервирующих растворов для пересадки. Все процедуры выполнялись под изофлурановым ингаляционным наркозом. Данное исследование было проведено в соответствии с законодательством Евросоюза об экспериментах над животными (Директива 86/609/CEE).

Подготовка печени и экспериментальные группы

Хирургическая операция была выполнена так, как описано в предыдущих исследованиях (I. Ben Mosbah et al., “Preservation of steatotic livers in IGL-1 solution”, Liver Transpl 2006, vol. 12(8), pp. 1215-23, and I. Ben Mosbah et al., “Addition of adenosine monophosphate-activated protein kinase activators to University of Wisconsin solution: a way of protecting rat steatotic livers” Liver Transpl., 2007, vol. 13(3), pp. 410-25). После канюлирования общего желчного протока изолировали воротную вену и накладывали лигатуру на селезеночную и пилорическую ветви. Все животные были случайным образом распределены по следующим экспериментальным группам, как описано ниже.

Консервирующие растворы и экспериментальные группы

Составы консервирующих растворов UW, IGL-1 и P1 приведены в Таблице 2, где P1 обозначает раствор, приготовленный в соответствии с настоящим изобретением.

A) Исследование I: сравнение растворов P1 и UW

1) UW: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе UW.

2) UW+CVD: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе UW, содержащем 10 мкМ карведилола.

3) UW+TMZ: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе UW, содержащем 1 мкМ триметазидина.

4) UW+TCR: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе UW, содержащем 5 мкМ такролимуса.

5) UW+CVD+TMZ+TCR: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе UW, содержащем 10 мкМ карведилола, 1 мкМ триметазидина и 5 мкМ такролимуса.

Результаты, полученные в группах 1-5 сравнивали с результатами, полученными при хранении печеней 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) в течение 24 ч при температуре 4°С в консервирующем растворе P1.

B) Исследование II: сравнение растворов P1 и IGL-1

1) IGL: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе IGL-1.

2) IGL+CVD: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе IGL-1, содержащем 10 мкМ карведилола.

3) IGL+TMZ: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе IGL-1, содержащем 1 мкМ триметазидина.

4) IGL+TCR: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе IGL-1, содержащем 5 мкМ такролимуса.

5) IGL+CVD+TMZ+TCR: Печени 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) хранили в течение 24 ч при температуре 4°С в растворе IGL-1, содержащем 10 мкМ карведилола, 1 мкМ триметазидина и 5 мкМ такролимуса.

Результаты, полученные в группах 1-5 сравнивали с результатами, полученными при хранении печеней 16 крыс Цукера (8 Ln и 8 Ob) в течение 24 ч при температуре 4°С в консервирующем растворе P1.

Методика проведения эксперимента

После 24 ч холодной консервации трансплантата измеряли уровень аланинаминотрансферазы (АЛТ), накопленной после длительной ишемии. Кроме этого после 24 ч холодной консервации трансплантата, для того чтобы сымитировать период тепловой ишемии, которой подвергается трансплантат во время операции по его пересадке реципиенту, печень в течение 30 мин подвергали воздействию температуры 22°С. Затем, через воротную вену печень подключали к системе рециркуляционной перфузии и перфузировали в течение 120 мин при температуре 37°С. В течение первых 15 мин перфузирования ток жидкости постепенно увеличивали, для того чтобы стабилизировать давление в воротной вене на уровне 12 мм рт. ст. (Pression Monitor BP-1; Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA). Ток жидкости регулировали при помощи перистальтического насоса (Minipuls 3, Gilson, France). Перфузионная жидкость состояла из питательной среды Уильяма E для культур клеток (Bio Whitaker, Spain) с альбуминовым раствором Кребса-Хензелайта. Перфузионную жидкость насыщали кислородом, используя газовую смесь, состоящую из 95% O₂ и 5% CO₂. Температуру перфузионной жидкости поддерживали на уровне 37°С. По окончании нормотермической реперфузии (120 мин) отбирали аликвоты перфузионной жидкости, для того чтобы определить количество АЛТ. Также определяли уровень выработки желчи, печеночный клиренс (% БСФ) в образцах желчи и содержание АТФ в образцах печени.

Определение биохимических показателей

— Определение трансаминаз . Уровень трансаминаз, в качестве показателя повреждения печени, определяли в соответствии с инструкциями к коммерческим наборам фирмы Боерингер Маннхейм (Boehringer Mannheim, Munich, Germany).

— Выработка желчи . Уровень выработки желчи оценивали как показатель функционирования печени. Желчь собирали через желчный проток, уровень выработки желчи оценивали путем измерения объема желчи, полученной после 120 мин перфузирования, и представляли в виде мкл/г печени.

— Печеночный клиренс БСФ. Как и уровень выработки желчи, печеночный клиренс БСФ рассматривается как еще один надежный показатель функционирования печени. БСФ (бромсульфофталеин) в количестве 10 мг добавляли в перфузионную жидкость через 30 минут после начала перфузирования. Концентрацию БСФ в образцах желчи определяли путем измерения поглощения при длине волны 580 нм. Печеночный клиренс БСФ выражали как % БСФ.

— Определение АТФ. Образцы печени гомогенизировали в растворе, содержащем хлорную кислоту, и уровень АТФ определяли при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Источник