иммунофенотипирование костного мозга что это

ТОМ 4, СТ. 132 (стр. 471-478) //

ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗОВ

Е.Е.Зуева *
Санкт-Петербургский Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Российская Федерация

Резюме
На сегодняшний день иммунофенотипирование онкогематологических заболеваний представляет собой одно из наиболее востребованных клинических приложений проточной цитометрии. Рассмотрены основные критерии выявления лейкозных бластов, верификации их линейной принадлежности и определения аберрантности фенотипа с использованием преимуществ многоцветного анализа.

Лабораторная диагностика ОЛ начинается с выявления в периферической крови, костном мозге, и, реже, спинномозговой жидкости бластных клеток, которые идентифицируются методом световой микроскопии. Подробное морфологическое и цитохимическое описание разных типов бластов в настоящее время обязательно присутствует в каждом руководстве по онкогематологии, но фактически требует от патолога значительного опыта и далеко не всегда дает однозначную оценку бластов. Детально разработанная в конце 70-х годов (1976-1980) гематологами и патологами Франции, США и Великобритании ФАБ-классификация (France-America-Britain) разделила острые лейкозы на лимфобластные и нелимфобластные (миелобластные). При оценке бластов миелоидного происхождения морфологические критерии ФАБ-классификации достаточно информативны, однако, для верификации бластов лимфоидного происхождения их применение признано нецелесообразным (ВОЗ, 2000). В настоящее время основой для диагностики гемобластозов (заболеваний, связанных с пролиферацией гемопоэтических клеток предшественников и клеток крови на разных стадиях дифференцировки) служит классификация ВОЗ 2000г.

Годы активного внедрения ФАБ-классификации в клиническую онокогематологию одновременно стали временем объединения фундаментальных открытий в биологии и биотехнологии, временем накопления знаний о путях дифференцировки клеток костного мозга, о роли Т- и В-лимфоцитов в развитии онкогематологических заболеваний, об особенностях лейкозных клеток. Поистине революционное значение для диагностической иммунологии и гематологии оказала разработка методов получения моноклональных антител, что было подтверждено в 1984 присуждением Нобелевской премии Kohler и Milstein вместе с Jerne за вклад в развитие теоретической иммунологии и биотехнологии. Создание гибридом вобрало в себя основные положения теории антителообразования: клональный принцип строения лимфоидной ткани, моноспецифичность антител, функционирование генов иммуноглобулинов только в лимфоидных клетках и их производных. Применение моноклональных антител в диагностике позволило охарактеризовать структуру и функцию линейно-ассоциированных и дифференцировочных антигенов, а затем и антигенов, экспрессия которых обусловлена активацией и пролиферативной активностью клеток. В 80-е годы прошлого века острый лейкоз рассматривался как блок дифференцировки клетки на определенной стадии ее развития, поэтому и варианты лимфобластных лейкозов получали свое название соответственно той стадии дифференцировки, антигены которой выявлялись на бластах в первую очередь. Дифференцировочный статус гемопоэтических новообразований определялся как «замороженная» стадия онтогенеза, т.е. аксиомой было сохранение опухолью направления и стадии дифференцировки клетки-предшественницы. Догмой онкогематологии было представление о том, что опухоли гемопоэтической системы представляют собой наиболее яркий пример сохранения дифференцировочного/антигенного статуса нормальных клеток при их опухолевой трансформации. И это рассматривалось как исключение из правила классической онкологии, согласно которому нарушение гистотипа с более или менее выраженной утратой тканевой специфичности является характерным признаком эпителиальной опухоли.

В настоящее время сохранение дифференцировочного статуса при всех формах гемобластозов расценивается как свидетельство существования различных форм взаимодействия трансформации и дифференцировки. Стало очевидно, что клональность происхождения не означает неизменности характеристик лейкозных бластов в течение болезни: антигенный дрейф, или изменение антигенной экспрессии в течение заболевания или в ответ на адекватную терапию является одним из отражений опухолевой прогрессии. Сохранение гемобластозами дифференцировочного статуса клетки-предшественницы в основном связано с тем, что опухолевая трансформация гемопоэтических клеток включает (запускает) механизмы нормальной дифференцировки и опирается на них. Эти механизмы участвуют как в самом процессе трансформации (ошибки физиологических рекомбинаций), так и в поддержании опухолевого фенотипа (активация протоонкогенов, блокировка созревания и т. д.). Одной из характеристик лейкозной клетки является ее способность избегать уничтожения либо за счет увеличения пролиферативного потенциала, либо за счет изменения продолжительности жизни. Клетка теряет способность воспринимать физиологические сигналы о необходимости прекращения функции, о необходимости к переходу в другое состояние для обеспечения поддержания нормального гомеостаза организма. Говоря иными словами, клетка учится избегать старения, увядания, т.е. всего того, что приводит ее к смерти. Необычно высокая экспрессия белков гиперсемейства генов, контролирующих клеточную гибель, вызывает изменение срока жизни клетки, популяции и влияет на эффективность отдельных видов химиотерапии. Баланс активности проапоптотических и антиапоптотических генов является в какой-то мере определяющим в формировании клинической картины лейкоза и особенностей его прогрессии. Тесное взаимодействие трансформации и дифференцировки является, по-видимому, уникальной особенностью гемобластозов и создает возможность их «дифференцировочной» терапии. Широкое, быстро превращающееся в рутинное использование моноклональных гуманизированных антител для терапии онкогематологических заболеваний подтверждает это положение. Моноклональные антитела, специфичные к антигенам опухолевых клеток-мишеней, становятся препаратами выбора для отдельных форм лимфопролиферативных заболеваний (Rituximab, Genistein, Campath и другие).

Иммунодиагностика гемобластозов основана на сопоставлении морфофункциональных характеристик лейкозных бластов и нормальных/нетрансформированных клеток гемопоэза. Известно, что нормальный процесс дифференцировки клеток в костном мозге и/или тимусе происходит с определенной, достаточно постоянной скоростью, определяемой потребностью организма в кроветворных и иммунокомпетентных клетках. По мере функционального созревания лимфоидных и миелоидных клеток происходит перестройка генов, кодирующих специфические рецепторы клеток, а значит, происходит изменение набора рецепторов для различных факторов роста, дифференцировки и межклеточного взаимодействия. По набору мембранных и цитоплазматических антигенов можно установить линейную принадлежность, стадию зрелости и функциональное состояние клетки. С начала 80-х годов ХХ века, когда развитие моноклональных антител пошло по экспоненте, стало возможным нарастающее по сложности иммунофенотипирование. Затем, качество реагентов и оборудования улучшилось, как следствие, методики стали проще и воспроизводимее. были разработаны программы внешнего контроля качества типирования ОЛ. К настоящему времени ИФТ превратилось в быстрый и полезный способ получения подробной характеристики опухолевых клеток, необходимой для диагностики ОЛ. Сходство между лейкозными и нормальными клетками позволяет установить линейность и стадию созревания патологических клеток, что необходимо для иммунофенотипического диагноза, классификации и прогностической оценки различных типов онкогематологических заболеваний. Фенотипические аберрации, характеризующие лейкозные клетки, позволяют выявлять случаи с максимальной вероятностью специфических генетических поломок, для подтверждения которых необходима молекулярная диагностика.

Для количественного определения популяционного состава лейкоцитов используется способность их рецепторов взаимодействовать со специфическими антителами с образованием стабильных комплексов на поверхностной мембране клетки. Фактически, как это часто бывает в жизни, мы определяем вещи (в данном контексте клетки) по признакам, не имеющим ничего общего с их функциями. Так и молекулы на мембране или внутри клеток, делая доступным и простым их распознавание по признаку антигенности, могут выполнять функции, отличные от иммунных.

На основании классической реакции антиген-антитело разработано довольно много способов количественного учета клеток, часть из которых имеет сугубо историческое значение, другие применяются в основном для научных исследований. Для практических целей максимально адаптированы и дают наиболее воспроизводимые результаты иммуноцитохимия (световая и люминесцентная микроскопия) и проточная цитометрия (рис.1). Однако не только в клинически сложных случаях, но и в повседневной практике микроскопирование все чаще уступает место проточной цитометрии, ставшей основным методом ИФТ в диагностике гемобластозов.

Выявление лейкозных бластов
Выявление лейкозных бластов в периферической крови и/или костном мозге методом проточной цитометрии основано на отличии их фенотипа от фенотипа неизмененных клеток. Нормальные клетки, сохраняющиеся в некотором количестве даже при выраженной опухолевой экспансии, могут использоваться как внутренний стандарт антигенной экспрессии. Именно уровень антигенной экспрессии и физические характеристики определяют местоположение каждой популяции клеток в многомерном пространстве проточной цитометрии.

При работе с бластными популяциями обогащение образца, т.е. отбор определенных, интересующих клеток можно проводить двумя путями:

o сохраняет возможность анализа образца в целом, всех составляющих его популяций;

o дает возможность выбрать любую нужную популяцию и определить ее иммунофенотипический профиль при дальнейшем, более прицельном анализе, не теряя дополнительное время на выделение суспензии мононуклеаров.

При диагностике гематологических заболеваний предпочтительно использовать селективное гейтирование, в частности, по панлейкоцитарному маркеру CD45. Гейтирование по гистограмме SSC/CD45 является удобным средством идентификации патологических клеток, так как обычно бласты занимают (на гистограмме SSC/CD45) такое положение, где располагается очень мало здоровых клеток. Особенно ярко это видно на образцах периферической крови (рис.2). При гейтировании по CD45 следует соблюдать определенную осторожность, так как

· ядросодержащие эритроидные клетки костного мозга, равно как и некоторые лейкозные клетки могут быть отрицательны по этому антигену;

· при Т-клеточных опухолевых процессах интенсивность СD45 очень высока, но для дифференциальной диагностики этот факт имеет ограниченную ценность;

При цитопении неясной этиологии и при отсутствии клеток волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ) с классической морфологией использование гистограммы SSC/CD45 может помочь выявить популяцию опухолевых клеток: трансформированные клетки располагаются в обычном месте расположения моноцитов, но средний уровень флюоресценции этих клеток по CD45 выше, чем у нормальных лимфоцитов и даже моноцитов.

Для получения подробной характеристики бластов при лимфобластных лейкозах более специфичным является гейтирование по CD19 или CD7 (соответственно SSC/CD19 и SSC/CD7). Линейно-ассоциированные лимфоидные бласты В- или Т-клеточного происхождения, экспрессирующие соответственно CD19 или CD7, обладают, как и лимфоциты, низким уровнем гранулярности и располагаются в строго определенном пространстве гистограммы. В гистограммах здорового костного мозга это пространство обычно пустует, там не располагаются нетрансформированные клетки (Рис.3). Использование определенного маркера для селективного гейтирования патологической популяции предполагает, что моноклональные антитела к этому маркеру должны быть включены во все пробирки, подготовленные к анализу на проточном цитометре Желательно, чтобы гейтирующий маркер был конъюгирован с флуорохромом для учета по третьему, или, если есть техническая возможность, по четвертому каналу флуоресценции, так как это дает максимальный простор для выбора других маркеров и определения их сочетанной экспрессии внутри патологической популяции.

Однако, даже теоретически, не может быть определен вариант гейтирования, подходящий для всех вариантов злокачественной трансформации гемопоэтических клеток. Поэтому так важно иметь широкий выбор диагностических моноклональных антител для определения фенотипа злокачественных клеток в разных клинических ситуациях. Информация о вариантах гейтирования, применяемых в онкологических центрах всего мира, постоянно публикуется в Интернете в открытом доступе. Необходимо, чтобы накопление опыта селективного гейтирования стало доступно отечественным врачам на родном языке в режиме реального времени (on-line).

При определенных усилиях процессы пробоподготовки (доаналитический этап) и получения данных (собственно аналитический этап) могут быть автоматизированы, что оправдано технически и экономически в крупных гематологических центрах, проводящих в день определение иммунофенотипа патологических клеток у большого количества пациентов (более 20-40 человек). Анализ же полученной информации, установление варианта лейкозной трансформации и соотнесение ее с данными других лабораторных технологий является задачей врача и требует накопления определенного опыта.

Определение количества лейкозных клеток
В большинстве случаев количество бластов указывается в миелограмме, сопровождающей костный мозг, направленный на ИФТ. Однако, на практике, материал стернальной пункции одновременно направляется морфологу для получения детальной миелограммы и иммунологу на иммунофенотипирование для определения варианта лейкоза, т.е. клеточность образца неизвестна. Первым следствием этого является необходимость вносить специфические антитела в некотором избытке, а не из расчета на количество клеток. Затем, для определения уровня бластоза при проточной цитометрии необходимо средствами программного обеспечения отделить собственно клетки от дебриса и от дуплетов клеток (слипшихся клеток), которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце. Дуплеты особенно часто наблюдаются при В-лимфопролиферативных заболеваниях и обладают более высокими значениями по светорассеянию и флуоресценции по сравнению с одиночными клетками. Если между временем получения костного мозга (периферической крови) и началом пробоподготовки проходит более двух-четырех часов или были грубо нарушены условия транспортировки, то из анализа должны быть исключены мертвые клетки в связи с их способностью к неспецифическому связыванию антител. В некоторых случаях, при вынужденном длительном хранении образца, в частности, при транспортировке из географически удаленных регионов, селективное гейтирование должно проводится по жизнеспособным клеткам, что может позволить анализировать только функционально сохранные клетки. Для оценки жизнеспососбности клеток анализируемого образца оптимально использование 7AAD (7-аминоактиномицин D), который может быть применен одновременно с антителами, мечеными ФИТЦ и фикоэритрином.

При определении количества лейкозных клеток в костном мозге, надо помнить о возможном разведении образца периферической кровью, что может серьезно влиять на конечный результат определения количества патологических клеток в образце. Характеристика лейкозных клеток
При выявлении в образце неопластических клеток и определении их количества должны быть решены две основные задачи ИФТ гемобластозов:

1) идентификация патологических клеток и

2) иммунофенотипическая характеристика бластов, в том числе

· определение линейной принадлежности бластов и уровня их дифференцировки;

· Определение степени гетерогенности клеток патологической популяции за счет выявления различных патологических клонов или наличия клеток на разных стадиях дифференцировки;

· получение подробной фенотипической характеристики каждой выявленной субпопуляции патологических клеток.

И если первая задача может быть выполнена в течение одного-двух часов, то формулировка диагноза требует иногда гораздо большего времени, особенно при низком уровне бластоза в образце.

Определение линейной принадлежности лейкозных бластов является обязательной частью обследования пациентов с подозрением на гемобластоз. Для этого может быть достаточной оценка экспрессии маркеров скриннинговой панели:

i) линейную принадлежность клеток определяют:
(a) миелоидные маркеры:
МПО, CD13, CD33;
(b) Лимфоидные маркеры:
1. Маркеры Т-лимфоцитов
i. CD2, CD7, cyCD3 и sCD3;
2. Маркеры В-лимфоцитов
i. CD10, CD19, cyCD22 и sCD22.
ii) незрелость клетки характеризуют TdT, CD34, HLA-DR.

Определение линейной коммитированности опухолевых клеток тем проще, чем больше дифферецировочных маркеров выявляется на их мембране. Трудности в определении линейной принадлежности бластов чаще всего связаны с отсутствием экспрессии линейных маркеров на поверхностной мембране клеток и с существованием перекрестной экспрессии линейных антигенов. Поверхностные линейно-ассоциированные маркеры не выявляются при опухолевой трансформации самых ранних клеток-предшествеников гемопоэза или, в отдельных случаях, утрачиваются при опухолевой прогрессии после химиотерапии. При отсутствии экспрессии линейных маркеров на поверхностной мембране клеток необходимо проводить выявление маркеров линейной принадлежности (миелопероксидаза, CD3, CD79a, CD22) в цитоплазме, что требует введения дополнительных шагов в протокол пробоподготовки. Для того, чтобы избежать необходимости последовательного проведения дополнительных окрашиваний, логичнее с самого начала включить в диагностическую панель несколько пробирок для выявления внутриклеточных антигенов. Это требует минимального увеличения времени пробоподготовки за счет фиксации и пермеабилизации, но компенсируется получением абсолютно достоверной информации о линейной принадлежности бластов.

Наиболее специфичным маркером Т-ряда является поверхностный и/или цитоплазматический CD3 и Т-клеточный рецептор (TCR). Предшественники Т-клеток ОЛЛ обычно положительны по CD7 и отрицательны по CD19. Для установления варианта Т-ОЛЛ необходимо оценить экспрессию CD1a, CD2, cyCD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD56, варианта TCR (Табл.2).

Одновременное отсутствие или аномальная реактивность с маркерами CD7 и CD19 при наличии позитивной реакции с миелоидными маркерами является доказательством нелимфоидного происхождения лейкоза даже при отсутствии МРО. Для миелоидных клеток наиболее высокоспецифичными маркерами являются миелопероксидаза и лизоцим. До настоящего времени иммунологическая классификация миелолейкозов до сих пор очень несовершенна (Табл.3). Исключением являются мегакариоцитарные маркеры CD61, CD41, CD42 и эритроидный антиген гликофорин А, с помощью которых можно верифицировать мегакариобластный лейкоз (ОМЛ, вариант М6) и острый эритромиелоз (ОМЛ, вариант М7), но именно эти формы максимально узнаваемы клинически и морфологически и редко требуют проведения ИФТ с диагностической целью.

При обнаружении на бластных клетках одновременной яркой экспрессии антигенов различных гемопоэтических линий, т.е. при подозрении на бифенотипический лейкоз (БФЛ) дополнительным шагом интерпретации данных ИФТ является балльная оценка экспрессии маркеров (табл.4). Она проводится, согласно рекомендациям Европейской группы по исследованию лейкозов (EGIL), если не менее 10-20% лейкозных бластов одновременно экспрессируют миелоидные и лимфоидные маркеры. Каждый маркер оценивается определенным баллом. Диагноз БФЛ ставится при оценке больше 2 для миелоидной и 1 для лимфоидной линии. Предполагая БФЛ надо обращать внимание на внутриклеточную экспрессию не одного, а как минимум двух маркеров миелоряда, чтобы избежать ошибочной гипердиагностики. Кроме того, нужно помнить, что этот вариант острых лейкозов на самом деле является достаточно редким, для него не разработано специфических схем полихимиотерапии (ПХТ). Больные получают ПХТ согласно группе риска, определяемой по совокупности данных клиники, морфологии, цитохимии, цитогенетики и ИФТ.

Использование многоцветного (мультипараметрического) анализа показало, что практически у всех пациентов с острыми лейкозами фенотип патологических клеток является аберрантным, т.е. не полностью соответствующим какому-то определенному уровню дифференцировки нормальной клетки крови. Эта аномальная экспрессия отражает генетические изменения, лежащие в основе опухолевого перерождения лейкозной клетки. Таким образом, именно аберрации антигенной экспрессии позволяют отделять/дискриминировать здоровые клетки от патологических при анализе биологического материала пациентов с подозрением на онкогематологическое заболевание. К основным типам аберрантности фенотипа при острых лейкозах относятся

· эктопическая, (например, тимус-ассоциированная при Т-ОЛЛ, т.е. выявление в костном мозге или периферической крови бластов с фенотипом тимических лимфоцитов);

· полное отсутствие или низкий уровень экспрессии антигена, характерного для данной стадии дифференцировки, например, в некоторых случаях острого миелолейкоза с признаками созревания уровень экспрессии линейного маркера несопоставим с уровнем его экспрессии на неизмененных клетках миелоряда (Рис.4);

· асинхронная, т.е. одновременная экспрессия антигенов, относящихся к разным стадиям дифференцировки (в норме никогда не определяется одновременная экспрессия ранних и поздних антигенов) (Рис.5 А);

· избыточная экспрессия антигена (например, очень высокий уровень экспрессии CD10 при B II варианте острого лимфобластного лимфобласте);

· фенотипический профиль, практически не встречающийся в норме (клетки с яркой экспрессией CD7 определяются в костном мозге в норме с частотой

Источник

• ← иммунофенотипирование костного мозга для чего делают
• иммунофенотипическая характеристика клеток костного мозга →