как на практике можно использовать цветные реакции на белок
Практическое значение цветных реакций
Цветные реакции, являясь универсальными (биуретовая, нингидриновая) и специфическими (реакция Фоля, ксантопротеиновая), позволяют установить белковую природу вещества, обнаружить белок и аминокислоты в растворе, изучить состав белков и пептидов.
Принцип этих реакций используется для количественного определения аминокислот и белков в биологических жидкостях.
Оформление работы
Результаты оформляют в виде таблицы, где отмечают полученный цвет раствора и интенсивность окраски. Интенсивность окраски обозначают следующим образом: ‘’–‘’ отсутствие окраски; ‘’+’’ слабая окраска; ‘’++’’ сильная окраска; ‘’+++’’ очень сильная окраска.
| Объект исследования | Реакции | |||
| Биуретовая | Нингидриновая | Ксантопротеиновая | Фоля | С нитропруссидом |
| Раствор яичного белка |
В выводах указывается на возможность обнаружения пептидных связей и некоторых типов аминокислот при помощи используемых реакций.
Лабораторная работа 2
Исследование наличия белка и свободных
аминокислот в биологическом материале
Химический состав биологических жидкостей (кровь, моча, желудочный сок, слюна и т.п.) характеризуется постоянством и отражает состояние биохимических процессов, происходящих в органах и тканях. Отклонение от нормы в качественном и количественном составах биологических жидкостей может быть показателями патологического процесса.
Материал исследования
Сыворотка крови, слюна, моча.
Реактивы
1) 0,5% р-р нингидрина, 2) 10% р-р NaOH, 3) 10% р-р трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 4) 5% р-р CuSO4.
Проведение анализа
С 5 каплями сыворотки, слюны и мочи проводят биуретовую реакцию (см. «Лабораторная работа 1»), определяя наличие или отсутствие белка в пробах.
Дальнейшие действия зависят от наличия или отсутствия белка в пробах:
o если жидкость не содержит белок, то с 10 каплями исследуемого материала проводят нингидриновую реакцию (см. «Лабораторная работа 1») для определения наличия или отсутствия a‑аминокислот;
o если в жидкости присутствует белок, то для последующего исследования берут 20 капель биологической жидкости, в нее добавляют 5 капель 10% раствора ТХУ и нагревают до осаждения белка. Белок отделяют центрифугированием или фильтрованием через бумажный фильтр (предварительно смочив фильтр водой).
Далее в безбелковом надосадке (или фильтрате) с помощью нингидриновой реакции определяют наличие или отсутствие a‑аминокислот. Для этого к нему добавляют 5 капель 0,5% р-ра нингидрина и нагревают в кипящей водяной бане.
Оформление работы
Результаты анализа вносят в таблицу. Знаками ‘’+’’ и «–‘’ отмечают результаты наблюдения.
Делают вывод о содержании белка и аминокислот в биологических жидкостях и его причинах.
| Объект исследования | Обнаруженные соединения |
| Белок | Свободные аминокислоты |
| Сыворотка крови Слюна Моча |
Практическое значение
Свойство биологических жидкостей изменять свой состав при патологии нашло применение в клинико-диагностических лабораториях для диагностики заболеваний и контроля лечения. Многие методы определения веществ требуют наличия безбелковой жидкости, поэтому они начинаются с удаления белка из раствора путем фильтрации или центрифугирования.
Цветные реакции на белок и аминокислоты используют в биохимических исследованиях для контроля полноты удаления белка из жидкости, наличия аминокислот в биологических средах, а также качественного анализа белковых лекарственных средств в фармацевтической практике.
Тема 1.2.
Структура и физико-химические свойства белков
Актуальность
Выделение белков из раствора (в том числе высаливание и денатурация) широко используется в медицине для диагностических целей, получения и очистки белковых лекарственных препаратов, в экспериментальных исследованиях.
Цель
Изучить физико-химические свойства белков (молекулярная масса, форма, ионизация, гидратация, растворимость) и основные типы структур белковых молекул.
Научиться осаждать белки из раствора разными методами и использовать способность к осаждению белков в лабораторной практике.
Вопросы для самоподготовки
1. Строение протеиногенных аминокислот. Образование пептидной связи в пептидах и белках.
Уровни организации структуры белковых молекул (первичная, вторичная, третичная, четвертичная).
Связи, участвующие в формировании уровней структуры белка. Функциональные группы аминокислот, ответственные за образование этих связей.
Четвертичная структура белков. Что такое комплементарность протомеров? В чем заключаются кооперативные изменения конформации протомеров?
Свойства белков: амфотерность, ионизация (заряд), гидратация, растворимость. Что такое изоэлектрическая точка?
Молекулярная масса пептидов и белков. Способы ее определения (ультрацентрифугирование, гель-фильтрация).
Свойства белковых растворов. Факторы, стабилизирующие белковую молекулу в растворе. Коллоидные свойства белков.
Денатурация белков. Факторы, вызывающие денатурацию белков (физические, химические, биологические). Свойства денатурированного белка.
Ренативация белка, ее механизмы.
Способы удаления белков из раствора: осаждение кислотами, тяжелыми металлами, органическими растворителями. Принцип реакций осаждения белка.
Способы очистки белковых растворов от примесей (высаливание, гель-фильтрация, диализ). Принцип методов.
Лабораторная работа №1
Лабораторная работа №1
ХИМИЯ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ.
ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ
Белки представляют собой высокомолекулярные полимерные органические соединения, построенные из остатков различных α-аминокислот, соединенных ковалентной пептидной связью.
Присутствие белка в растворах можно обнаружить с помощью цветных реакций, обусловленных наличием в белке аминокислот, их специфических групп и пептидных связей. Существуют универсальные цветные реакции, т. е. на все белки (биуретовая и нингидриновая), и специфические, т. е. на определенные аминокислоты (ксантопротеиновая, Миллона, Фоля и др.).
На основании некоторых цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот, которые широко используются в биохимических лабораториях.
Цель: Ознакомиться с универсальными цветными реакциями на белки и специфическими реакциями на отдельные аминокислоты, содержащиеся в белковых растворах.
Работа 1. Биуретовая реакция на пептидную связь (Пиотровского)
Биуретовая реакция обусловлена наличием в белке пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с сернокислой медью комплексы фиолетового цвета с красным или синим оттенком. Группа, образующая пептидную связь, в щелочной среде присутствует в своей таутомерной енольной форме:
При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд, с помощью которого кислород взаимодействует с медью. Возникает солеобразная связь. Кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их электронных пар. Возникающий таким образом комплекс очень стабилен. Интенсивность окраски комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе.
Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.
Реактивы: 10% раствор NaOH, 1% раствор CuSO4.
Оборудование: пробирки, капельницы.
Ход работы. К 5 каплям водного раствора белка добавляют 5 капель 10% раствора NaOH и 2 капли 1% раствора CuSO4. Содержимое перемешивают. Оно приобретает сине-фиолетовый цвет. Нельзя добавлять избыток CuSO4, так как синий осадок маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса.
Работа 2. Нингидриновая реакция на α-аминокислоты
Белки, полипептиды и свободные α-аминокислоты дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином. При нагревании белка с водным раствором нингидрина аминокислоты окисляются и распадаются, образуя СО2, NH3 и соответствующий альдегид. Нингидрин, являясь сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование α-аминокислоты, приводящее к образованию аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина – в желтый цвет.
Как на практике можно использовать цветные реакции на белок
Цветные реакции на белки
3. Цветные реакции на белки
Цветные реакции применяются для установления белковой природы веществ, идентификации белков и определение их аминокислотного состава в различных биологических жидкостях. В клинической лабораторной практике эти методы используются для определения количества белка в плазме крови, аминокислот в моче и крови, для выявления наследственных и приобретенных патологий обмена у новорожденных.
Биуретовая реакция на пептидную связь.
В основе ее лежит способность пептидных связей (-CO-NH-) образовывать с сульфатом меди в щелочной среде окрашенные комплексные соединения, интенсивность окраски которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор белка дает сине-фиолетовое окрашивание.
1) яичный белок, 1% раствор (белок куриного яйца фильтруют через марлю и разводят дистиллированной водой 1:10);
Сущность реакции состоит в образовании соединения, окрашенного в сине-фиолетовый цвет, состоящего из нингидрина и продуктов гидролиза аминокислот. Эта реакция характерна для аминогрупп в 
-положении, присутствующих в природных аминокислотах и белках.
1) яичный белок, 1% раствор;
2) нингидрин, 0,5% водный раствор
Ход определения. В пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, затем 5 капель нингидрина, нагревают смесь до кипения. Появляется розово-фиолетовое окрашивание, переходящее с течением времени в сине-фиолетовое.
При добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты и нагревании появляется желтое окрашивание, переходящее в присутствии щелочи в оранжевое. Сущность реакции состоит в нитровании бензольного кольца циклических аминокислот азотной кислотой с образованием нитросоединений, выпадающих в осадок. Реакция выявляет наличие в белке циклических аминокислот.
1) яичный белок, 1% раствор;
2) концентрированная азотная кислота;
Ход определения. К 5 каплям раствора яичного белка добавляют 3 капли азотной кислоты и (осторожно!) нагревают. Появляется осадок желтого цвета. После охлаждения добавляют (желательно на осадок) 10 капель NaOH, появляется оранжевое окрашивание.
Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.
1) неразбавленные яичный белок,
2) концентрированная (ледяная) уксусная кислота;
3) концентрированная серная кислота.
Ход определения. К одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной кислоты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют по каплям 0,5 мл серной кислоты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.
1) яичный белок, 1% раствор;
2) реактив Фоля ( к 5% раствору ацетата свинца прибавляют равный объем 30% раствора NaOH до растворения образовавшегося осадка).
Ход определения. К 5 каплям раствора белка прибавляют 5 капель реактива Фоля и кипятят 2-3 мин. После отстаивания 1-2 мин. появляется черный или бурый осадок.
Лабораторная работа Цветные реакции на белки
Цветные реакции на белки
тип урока: Урок-практикум.
Цель: Закрепить и применить знания по теме «Цветные реакции на белки»
Развить практические умения и навыки при работе с химическим оборудованием.
Воспитание аккуратности при выполнении опытов.
I Актуализация знаний.
1. Правила ТБ при выполнении лабораторной работы.
2. Обнаружение в белках пептидных связей.
II Закрепление знаний
1. Цветные реакции на белки
1) Обнаружение в белках пептидных связей (биуретовая реакция)
Эта реакция обусловлена наличием в белковой молекуле пептидных связей, возникающих при взаимодействии молекул аминокислот.
В результате взаимодействия ионов двухвалентной меди с пептидными связями в щелочной среде образуется комплексное соединение, окрашенное в красно-фиолетовый цвет.
Ход работы: к 5 каплям исследуемого раствора белка и желатина добавляем 3 капли 10% р-ра NaOH и 1 каплю 1 % р-ра CuSO4. При наличии белка в пробирке появляется устойчивое сине-фиолетовое окрашивание.
2) Ксантопротеиновая реакция
Эта реакция основана на образовании нитропроизводных ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан). Нитропроизводные имеют желтую окраску в кислой среде и оранжевую – в нейтральной и щелочных средах (ксантос – по-гречески – желтый).
Ход работы: берут 2 пробирки и наливают в первую 5 капель раствора яичного белка, а во вторую – 5 капель раствора желатина. Затем в обе пробирки добавляют по 3-5 капель концентрированной азотной кислоты. Выпадает осадок свернувшегося белка
2. Практическая значимость работы
Практическое применение цветных реакций имеет следующие аспекты:
1. Биуретовая реакция используются для качественного обнаружения белков.
2. Специфические цветные реакции применяются для идентификации аминокислотного состава исследуемого белка, а также для качественного обнаружения белка, если соответствующая группировка входит в его состав.
III Применение знаний и умений.
Результаты опытов занести в таблицу:
Чем обусловлена реакция
Домашнее задание: Повторить тему, выучить выводы.
к лабораторной работе «Цветные реакции на белки»
1) Биуретовая реакция (обнаружение в белках пептидных связей)
Эта реакция обусловлена наличием в белковой молекуле пептидных связей, возникающих при взаимодействии молекул аминокислот.
В результате взаимодействия ионов двухвалентной меди с пептидными связями в щелочной среде образуется комплексное соединение, окрашенное в красно-фиолетовый цвет.
Ход работы: к 5 каплям исследуемого раствора белка и желатина добавляем 3 капли 10% р-ра NaOH и 1 каплю 1 % р-ра CuSO4. При наличии белка в пробирке появляется устойчивое сине-фиолетовое окрашивание.
2) Ксантопротеиновая реакция
Эта реакция основана на образовании нитропроизводных ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан). Нитропроизводные имеют желтую окраску в кислой среде и оранжевую – в нейтральной и щелочных средах (ксантос – по-гречески – желтый).
Ход работы: берут 2 пробирки и наливают в первую 5 капель раствора яичного белка, а во вторую – 5 капель раствора желатина. Затем в обе пробирки добавляют по 3-5 капель концентрированной азотной кислоты. Выпадает осадок свернувшегося белка
Практическая значимость работы
Практическое применение цветных реакций имеет следующие аспекты:
Биуретовая реакция используются для качественного обнаружения белков.
Специфические цветные реакции применяются для идентификации аминокислотного состава исследуемого белка, а также для качественного обнаружения белка, если соответствующая группировка входит в его состав.
Результаты опытов занести в таблицу:
Цветные реакции на белки
Ищем педагогов в команду «Инфоурок»
Белок и всё о нём в биологии и химии < belok-s.narod.ru >
Цветные реакции на белки
Цветные реакции применяются для установления белковой природы веществ, идентификации белков и определение их аминокислотного состава в различных биологических жидкостях. В клинической лабораторной практике эти методы используются для определения количества белка в плазме крови, аминокислот в моче и крови, для выявления наследственных и приобретенных патологий обмена у новорожденных.
Ход определения. В пробирку вносят 5 капель р-ра яичного белка, 3 капли NaOH, 1 каплю Cu ( OH )2, перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовое окрашивание.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) нингидрин, 0,5% водный р-р.
Ход определения. В пробирку вносят 5 капель р-ра яичного белка, затем 5 капель нингидрина, нагревают смесь до кипения. Появляется розово-фиолетовое окрашивание, переходящее с течением времени в сине-фиолетовое.
Реакция выявляет наличие в белке циклических аминокислот.
Реакция Адамкевича. Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.
Реактивы: 1) неразбавленные яичный белок; 2) конц. (ледяная) уксусная к-та; 3) конц. серная к-та.
Ход определения. К одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной к-ты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют по каплям 0,5 мл серной к-ты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.
Ход определения. К 5 каплям р-ра белка прибавляют 5 капель реактива Фоля и кипятят 2-3 мин. После отстаивания 1-2 мин появляется черный или бурый осадок.