какие красители применяют в микробиологической практике

Краски, применяемые в микробиологической практике

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №2

Тема: Строение и химический состав бактериальной клетки. L-формы бактерий, возбудителей заболеваний человека. Тинкториальные свойства бактерий, окраска по методу Грама и другие сложные методы окраски.

Цель: Изучить строение клеточной стенки микроорганизмов. Освоить сложные методы окраски для выявления отдельных органоидов бактериальной клетки.

Знать:

· Строение клеточной стенки бактерий. Химический состав и функциональное назначение.

· Особенности строения и химического состава клеточной стенки у грамположительных и грамотрицательных бактерий.

· L-формы бактерий. Особенности оболочки этих форм бактерий. Факторы, которые влияют на образование протопластов и сферопластов.

· Этапы окраски по Граму.

· Механизм дифференциальной окраски по Граму.

· Капсула и ее биологическая роль для бактериальной клетки. Химический состав капсулы.

· Внутриклеточные включения. Биологическая роль в жизнедеятельности бактерий. Методы выявления.

· Биологическое значение спор и условия их образования.

· Чем обусловлена термоустойчивость спор?

· Функция и строение жгутиков бактерий. Методы их выявления.

· Уметь проводить дифференциацию бактерий по тинкториальным свойствам.

· Владеть техникой контрастирования капсул у бактерий по Бурри-Гинсу.

· Овладеть техникой изготовления мазка из агаровых культур бактерий.

· Приготовить препарат и окрасить его с целью выявления спор в культуре микроорганизмов.

· Уметь окрасить препарат для дифференциальной окраски по Граму.

· Выявить наличие жгутиков в культуре с помощью метода Леффлера.

· Какие компоненты составляют оболочку бактерий, какой из них определяет тинкториальные свойства бактерий?

· Каковы методики окраски микроорганизмов сложными методами окраски?

· В чем сущность окраски по Граму?

· Как контролируется правильность окраски по Граму?

· Кислотоустойчивые бактерии. Особенности химического состава клеточной стенки.

· Споры у бактерий. Их биологическое значение и условия образования.

· Методы выявления кислотоустойчивых бактерий и спор.

· Морфология микоплазм. Особенности ультраструктуры.

· Функция и строение жгутиков бактерий. Методы их выявления.

Краски, применяемые в микробиологической практике

Для окрашивания микроорганизмов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:

синие — метиловый синий, водный синий, опаловый синий;

красные — фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый;

Источник

Тема 2 бактериологические красители. Приготовление бактериальных препаратов для световой микроскопии. Простые методы окраски бактерий

Цель занятия. Ознакомить студентов с основными бактерио­логическими красителями, техникой их приготовления и мето­дом простой окраски бактериальных препаратов.

Оборудование и материалы. Набор сухих бактериологических красок и их растворов, культуры бактерий на МПА и в МПБ (Е. coli, S. aureus), световые микроскопы, обезжиренные пред­метные стекла, фуксин Пфейффера, красящие бумажки по Си­неву, раствор метиленового синего, фильтровальная бумага для высушивания мазков, физиологический раствор.

Обычно форму, взаимное расположение, некоторые особенно­сти химического состава и строения бактериальных клеток опре­деляют путем микроскопии окрашенных препаратов. Оптическая плотность неокрашенных бактерий близка к оптической плотнос­ти стекла, поэтому бактерии плохо различимы при микроскопиро-вании. Окрашенные клетки, наоборот, четко видны. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы в процессе обработки инактивируются, что делает препарат безопасным для исследователя.

Отношение к различным красителям и методам окраски на­зывают тинкториальными свойствами микроорганизмов.

Бактериологические красители. Для окрашивания бактериаль­ных клеток применяют синтетические анилиновые красители, которые дифференцируют на основные и кислые. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых — анион. Структуры бактерий, взаимо­действующие с красителем, преимущественно отрицательно за­ряжены и поэтому лучше воспринимают основные красители.

Основные красители. Красные (нейтральный красный, пиро-нин, сафранин, основной фуксин); фиолетовые (генциан фиоле­товый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин, тионин); синие (виктория, метиленовый синий); зеленые (малахитовый зеленый, метиленовый зеленый, янус зеленый); коричневые (везувин, хризоидин); черные (индулин).

Кислые красители. Розовые и красные (кислый фуксин, эозин, эритрозин, гропеолин); желтые (аурантил, конго, пикриновая кислота); черные (нигрозин).

Спиртовые растворы. Эти растворы длительного хранения го­товят из сухих порошковых красок. Растворы сначала выдержи­вают в термостате для лучшего растворения веществ, затем филь­труют через бумажные фильтры, чтобы избавиться от нераство­рившихся микрочастиц, которые при окраске препаратов оседа­ют на клетках, тем самым затрудняя их изучение под микроско­пом.

Далее приведены рецепты спиртовых растворов красок, наи­более часто применяемых в микробиологии.

Карболовый фуксин Циля: раствор А: основной фуксин —0,3 г, 96%-й этанол —10 мл; раствор Б: фенол — 5 г, вода дистиллированная — 95 мл. Растворы А и Б смешивают.

Фуксин Пфейффера — это фуксин Циля, разведен­ный водой в соотношении 1 : 10 (из-за нестойкости используют только в течение рабочего дня).

Карболовый кристаллический фиолето­вый: раствор А: кристаллический фиолетовый — 0,4 г, 96%-й этанол — 10 мл; раствор Б: фенол — 1 г, вода дистиллирован­ная — 100 мл. Растворы А и Б смешивают.

Щелочной метиленовый синий Леффлер а: раствор А: метиленовый синий — 0,3 г, 96%-й этанол — 30 мл; раствор Б: 0,01%-й раствор гидроксида калия — 100 мл. Ра­створы А и Б смешивают.

Водные растворы. Так как эти растворы красителей нестойкие, их готовят непосредственно перед использованием (ex tempore).

Раствор сафранина: сафранин — 2 г, вода дистилли­рованная горячая (/= 90 °С) — 100 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор малахитового (бриллиантового) зеленого: малахитовый зеленый — 1 г, вода дистиллирован­ная горячая —100 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор Люголя — стойкий раствор используют для окраски по методу Грама: йод кристаллический — 1 г, йодид ка­лия—2 г, вода дистиллированная — 10 мл. Смесь выдерживают 24 ч при 37 °С, после чего добавляют дистиллированную воду до 300 мл и одну-две капли глицерина.

Приготовление бактериальных препаратов для световой микроско­пии. Приготовление окрашенных бактериальных препаратов вклю­чает в себя приготовление мазка, его высушивание, фиксацию и окрашивание. Материалом для исследования служат культуры бак­терий на плотных или жидких питательных средах или нативный материал: органы, ткани, воспалительный экссудат и т. д. Препара­ты готовят на чистых, обезжиренных предметных стеклах.

Аналогичным образом готовят мазок из агаровой культуры, осторожно захватывая петлей бактериальную массу с поверхнос­ти питательной среды. На предметное стекло в этом случае пред­варительно наносят каплю стерильного физиологического ра­створа, в котором петлей суспендируют бактериальную массу.

Из животных тканей готовят мазки-отпечатки: стерильно вы­резают кусочек органа, поверхностью среза несколько раз каса­ются поверхности предметного стекла.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе.

Мазок фиксируют для прикрепления бактериальных клеток к поверхности стекла и их инактивации. Применяют физичес­кий и химический способы фиксации. При физическом способе препарат обратной стороной стекла два-три раза мед­ленно проводят над пламенем горелки. Чрезмерное нагревание вызывает изменение формы клетки и ее тинкториальных свойств. При химическом способе на предметное стекло с маз­ком наносят одну из следующих жидкостей: 96%-й этанол — на 10 мин; ацетон — на 5 мин; смесь этанола и эфира (соотношение 1 : 1) — на 10. 15 мин.

Фиксированный препарат окрашивают одним из методов.

Раствор краски смывают дистиллированной водой, препарат подсушивают фильтровальной бумагой или на воздухе и микроскопируют.

Процедуру окрашивания препарата проводят на «мостике» (параллельные стеклянные трубки) над сливной чашкой.

Простые методы окраски бактерий. При этом способе окраши­вания используют один краситель: например, на мазок наносят фуксин Пфейффера на 2. 3 мин или метиленовый синий Леффлера на 3. 10 мин. В таком препарате можно определять форму клеток, их взаимное расположение.

Источник

Какие красители применяют в микробиологической практике

био запись закреплена

19 ВОПРОС ОТЛИЧИЕ ПРОСТЫХ МЕТОДОВ ОКРАСКИ ОТ СЛОЖНЫХ.КАКИЕ КРАСИТЕЛИ ПРИМЕНЯЮТ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.

При простых методах окраски используется лишь одна краска.

С этой целью в бактериологии используются, как правило, или водный фуксин или метиленовая синька. Простые методы окраски используются для ориентировочной, предварительной, микроскопии – определения наличия в патологическом материале бактерий, определение их формы и расположения в мазке.

При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные.
2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.
3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).
4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.
5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.
6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.
7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.

Источник

Методы окраски микробиологических препаратов

Клеточная стенка бактерий является их важным отличительным признаком.

В целях более подробного изучения клеточных структур бактерий микробиологические препараты окрашивают. Можно окрашивать живые бактериальные формы, однако такая окраска не даёт полной картины строения микробной клетки. В связи с этим приготавливают фиксированные препараты микроорганизмов. Фиксация убивает живые клетки и одновременно закрепляет их на поверхности предметного стекла.

Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Высушивание мазка лучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например, их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором.

Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.

По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время.

Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Окраска по Граму (сложное окрашивание микроорганизмов) и ее использование для дифференциации бактерий с различным строением клеточной стенки.

Данный сложный (использующий более одного действующего вещества) метод окраски впервые был предложен в 1884г. датским ученым Х. Грамом (Ch.Gram) для окрашивания тканей, а позднее получил широкое распространение при окраске прокариот и был назван именем его разработчика.

Важное значение метода окраски по Граму в микробиологии определяется тем, что результаты окрашивания бактерий оказываются напрямую связанными с особенностями строения их клеточных стенок. Объяснением этого являются выраженные различия в строении клеточных стенок грамположительных (по данному методу окрашивающихся в фиолетовый цвет) и грамотрицательных (по данному методу окрашивающихся в красный цвет)бактерий. Первые из них имеют достаточно толстые слои из муреина (у эубактерий) или псевдомуреина (у архебактерий), удерживающие образующийся в протопласте комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и препятствующие его вымыванию из клетки при последующей обработке спиртом.

В свою очередь грамотрицательные бактерии не образуют подобных гетерополисахаридов или содержат их в небольших количествах, недостаточных для предотвращения экстрагирования комплекса красителя с йодом из протопласта при его обработке спиртом. Сказанное объясняет, почему несмотря на кажущуюся простоту метода Грама, именно он получил наибольшее распространение в качестве важного таксономически значимого теста, с результатами которого хорошо коррелируют многие прочие свойства прокариот.

Для реализации данного метода готовят специальный краситель – карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового: 1 г красителя растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до консистенции кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 мл 96 % спирта, окончательно разводят 100 мл дистиллированной воды, сливают в бутыль, отстаивают и через сутки фильтруют. Вторым важным компонентом для окраски по Граму является раствор Люголя: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г иодида калия и 1 г иода кристаллического, смесь хорошо укупоривают и оставляют на сутки, после чего добавляют 300 мл дистиллированной воды.

Процедура окрашивания по Граму начинается с обработки фиксированных бактериальных клеток красителем кристаллическим фиолетовым, за чем следует обработка клеток раствором иода. Эти два компонента вместе образуют крупномолекулярный комплекс, нерастворимый в воде и слабо растворимый в спирте. Поэтому, используя спирт, клетки дифференцируют: при промывании в нем «грамположительные» клетки удерживают комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и остаются синими, а «грамотрицательные» обесцвечиваются. Для того же, чтобы также сделать их видимыми, образцы дополнительно окрашивают каким-либо контрастным красным красителем – обычно фуксином.

Среди множества предложенных в настоящее время вариантов, окрашивания по Граму (по Г.П. Калине, по Эткинсу и др.) достаточно широкое распространение получила модификацияпо А.И. Синеву, для реализации которой предварительно готовят полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового и высушенной.

Процедура сложного окрашивания микроорганизмов:

1) на предметном стекле готовят мазок бактериальной культуры, который фиксируют над пламенем горелки;

2) на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового, на который наносят 2-3 капли воды и выдерживают в течение 2 мин;

3) снимают фильтровальную бумагу;

4) не смывая водой (!) на препарат наносят 2-3 капли раствора Люголя и выдерживают в течение 1 мин;

5) сливают раствор Люголя;

6) опускают предметное стекло в стаканчик с 95 % спиртом, где тщательно прополаскивают препарат в течение 0,5-1 мин, пока не перестанет отходить краситель;

7) тщательно промывают препарат водой;

8) наносят на предметное стекло раствор водного фуксина и прокрашивают препарат в течение 0,5-1 минут;

9) краситель сливают, тщательно промывают препарат водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

Считается, что в большинстве случаев интерпретация результатов окраски мазка по Граму не представляет трудностей, однако некоторые грамположительные микроорганизмы, в частности представители рода Bacillus, могут иметь грамотрицательную окраску. Напротив, некоторые штаммы грамотрицательных родов Acinetobacter и Moraxella проявляют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, поэтому выглядят грамположительными.

Для уточнения таких «грам-сомнительных» реакций предложены особые методы. В Японии предложили метод «тяжа», позволяющий отличить с помощью КОН-теста грамотрицательные микроорганизмы от грамположительных. В основе метода с КОН лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как клеточная стенка грамотрицательных микроорганизмов разрушается при указанном воздействии.

Методика выполнения работы.

Образование слизистой консистенции после обработки грамотрицательных бактерий КОН обусловлено выходом из их клеток ДНК, являющейся вязким компонентом.

Источник

Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Руководство к практическим занятиям по микробиологии ( малый практикум) Ульяновск 2003 удк 619 616. 9

ЗАНЯТИЕ 2. Бактериологические краски. Простой метод окрашивания.

Цель занятия. Овладеть методикой приготовления мазка-препарата для микроскопии из микробной взвеси. Ознакомиться с методами приготовления красящих растворов. Отработать методику простого метода окраски приготовленных препаратов.

МИКРОСКОПИЯ БАКТЕРИЙ В ОКРАШЕННОМ ВИДЕ

На предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.

Приготовление мазков. Исследуемый материал распределя­ют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обез­жиренного стекла.

Мазки готовят из культур микробов, патологического ма­териала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов. Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов:

1.Приготовление мазка на обезжиренном предметном стекле. 2.Высушивание препарата. 3.Фиксация мазка.

В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жид­кого патологического материала (моча и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости на­носят бактериальной петлей на предметное стекло и круго­выми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр об­разующегося мазка соответствовал величине копеечной мо­неты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в “толстой капле” распределяется не равномерно, образуя неровный край.

4. Приготовление мазка из вязкого мате­риала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу. После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределённым материалом, занимающим большую часть.

5. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидко­сти стала слегка мутноватой. После этого излишек микроб­ного материала на петле сжигают в пламени горелки и при­ступают к приготовлению мазка по описанному выше способу.

6. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому ме­сту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределя­ют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем пли бактериальной петлей. Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпе­чатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают по­верхностью среза к предметному стеклу несколько раз по­следовательно, получая, таким образом, ряд мазков-отпе­чатков.

Рис. 4 Схема приготовления препарата-мазка

Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают и после высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или 1 и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикла­дывают к тыльной поверхности левой кисти. При правиль­ном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют химические вещества такие как: Безводный метиловый спирт. Этиловый (винный) спирт 96%. Жидкость Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1). Жидкость Карнуа (спирта 96% 60 мл, хло­роформа 30 мл, уксусной кислоты ледя­ной 10 мл)

Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.

Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, что предложено А. И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски.

Окраска мазков красящей бумагой. На высу­шенный и фиксированный препарат наносят несколько ка­пель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2х2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется мето­дом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно сни­мают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.

Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь ма­зок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание произ­водят через фильтровальную бумагу, задерживающую части­цы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор краси­теля.

ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ

Краски, применяемые в микробиологической практике. Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:

При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1—2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10—30 секунд, а метиленовой синькой – 2-10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.

При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает зна­чительно бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спиртоводными растворами красок.

Для повышения красящей способности воздействуют на краску высо­кой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения). Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски. Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски.

Мытье предметных и покровных стекол . Предметные и по­кровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Пред­метные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи. Стекла предметные и покровные, не бывшие в употребле­нии, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания за­ливают смесью Никифорова. Если стекла, выну­тые через 2—3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2—5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20—30 мин. После кипячения в щелочном растворе стекла ополаскивают проточной водопроводной во­дой, опускают на 10—15 мин в 5—10% раствор хлористо-водородной кислоты и затем промывают проточной водой. Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении, загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабатыва­ют следующим способом:

-опускают на 2 ч в концентриро­ванную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщатель­но промывают проточной водопроводной водой;

-заливают 5% раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкое ка­ли или едкий натр), ставят на слабый огонь и кипятит в те­чение 30—40 мин.

Источник