применение автоклавов в биотехнологии

Автоклав лабораторный: что это, виды, принцип работы, применение

Стерилизатор — разновидность лабораторного оборудования, предназначенного для обработки медицинских приборов, инструментов, расходных материалов.

Что это такое?

Автоклавом называется аппарат, который позволяет проводить широкий спектр процессов при повышенном давлении и увеличенной температуре. Некоторые реакции ускоряются в таких условиях, что дает возможность за ограниченный промежуток времени решить большее количество задач.

Автоклавы широко используются в химической промышленности, где их называют «реакторами», и в медицине, где с помощью более простых версий производится стерилизация медицинских приборов и расходных материалов. Первое оборудование, исполнявшее сходные функции, было представлено еще в XVII веке изобретателем Дэни Папеном. Сегодня они незаменимы в промышленности и лабораториях Москвы и других городов России.

Виды автоклавов

Автоклавы классифицируются в зависимости от сферы применения. По типу движения различают вращающиеся, горизонтальные, качающиеся, вертикальные и колонные, причем горизонтальные пользуются в медицинской и лабораторной сферах большим спросом. Дополнительно они — при необходимости — оснащаются контрольно-измерительными приборами, наружными теплообменниками, устройствами для перемешивания.

Конструкция и принцип работы автоклава

Все автоклавы, вне зависимости от области применения, обладают схожей конструкцией. Внешне они представляют из себя герметичную емкость с возможностью регулировать давление и температуру. Устройства оборудуются системой подачи и отвода пара с фильтрацией и конденсацией. Объем, комплектация, давление, цена и другие показатели зависят от сферы эксплуатации прибора: так, например, в строительстве пользуются агрегатами диаметром до 6 м с длиной трубы около 20 м.

В качестве теплоносителя используется водяной пар. Давление нужно для того, чтобы разогреть воду выше 100°С. При разогревании воды до 90°С она начинает испаряться, заполняя собой все пространство камеры, при этом система эффективно убирает из нее кислород так, чтобы оставался только пар. Это приводит к росту давления и увеличению точки кипения воды. Как результат, поступаемый материал обрабатывается водой, температура которой значительно превосходит 100°С. Если речь идет о стерилизации, то разогретый до таких показателей пар с легкостью разрушает клетки микроорганизмов, в том числе весьма устойчивых споров.

Использование автоклавов

Автоклавы востребованы в химической промышленности, где с их помощью производят красители, гербициды и органические полупродукты. В гидрометаллургии в них выщелачивают драгоценные металлы, а в резиновой промышленности — вулканизируют технические изделия. Они совершенно незаменимы в пищевых структурах, ведь консервация пищи иначе практически невозможна.

В медицине, стоматологии, даже в деятельности тату-салонов автоклавы применяются для стерилизации приборов и расходных материалов.

Разумеется, использование не ограничивается только крупными предприятиями. Малые и средних размеров приборы используются в бытовых условиях — с их помощью готовят овощные, рыбные и мясные консервы. Они могут быть как «покупными», так и самодельными, изготовленными из ресивера или баллона с газом.

Источник

Работа 2. Методы стерилизации в биотехнологии

Работа 2. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Цель работы: ознакомиться со способами стерилизации в биотехнологии растений.

Объяснение. Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов.

Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5-2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15-20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном – газом, токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом.

Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1-2 атмосферы и температурой 120оС в течение 20-60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала.

Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в биксы.

Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170-250оС в течение 1-2 часов.

Материалы и оборудование. Чашки Петри, колбы с дистиллированной водой, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, препаровальные иглы, пинцеты, скальпели, вата, марля, бумага: фильтровальная и целлофановая.

1. Металлические инструменты завернуть в плотную бумагу и поместить в сушильный шкаф для стерилизации сухим жаром при to 170-200oС в течение 2 часов.

2. Чашки Петри, штативы с пробирками, заполненными питательной средой, вату, марлю, фильтровальную бумагу, колбы с дистиллированной водой (закрытые фольгой) завернуть в целлофановую бумагу и поместить в автоклав.

3. Автоклав привести в рабочее состояние: закрыть плотно крышку, воду залить до метки. Включить автоклав, давление пара довести до метки 1,2 атм. (в паровой камере), заполнить паром стерилизационную камеру, вытеснить конденсат в течение 10 минут, при этом давление пара в стерилизационной камере должно быть на уровне 0,1-0,2 атм. Довести давление в стерилизационной камере до 1 атм., включить автоматический режим.

4. Автоклавировать 20 минут при давлении в стерилизационной камере 1-1,2 атм.

5. Отключить автоклав, вытеснить пар из обеих камер довести давление до 0 атм.

6. Проавтоклавированные материалы перенести в комнату для пересадки тканей и поместить в шкафы или на стеллажи.

Работа 3. СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСПЛАНТОВ

Цель работы: ознакомиться со способами стерилизации растительного материала, подобрать концентрации стерилизующих растворов и время стерилизации семян различных культур.

Объяснение. С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду.

Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи.

Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Са и Nа), бром (бромной водой), перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками.

Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями.

Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут.

Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой.

Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена – 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза.

Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой.

Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте.

Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие.

Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри, колбы с автоклавированной дистиллированной водой, колбы со стерилизующими растворами, зерновки пшеницы, ржи, тритикале, семена гороха, фасоли и др. культур, ламинар-бокс, 96 % этиловый спирт, вата, спиртовка, пинцеты, фильтровальная бумага.

1. Отобрать 15-20 здоровых зерновок пшеницы, ржи, тритикале, гороха или др. культур.

2. В ламинар-боксе поместить семена в чашки Петри со стерилизующими растворами (6 % хлорамин, 6 % гипохлорит кальция или натрия, 96 % спирт, 7% перекись водорода, вода). Время стерилизации подобрать экспериментально.

3. Отмыть семена от стерилизующих растворов дистиллированной автоклавированной водой.

4. Поместить семена для проращивания в стерильные чашки Петри на стерильную фильтровальную бумагу в небольшое количество стерильной дистиллированной воды. Чашки Петри закрыть и перенести в термостат для проращивания.

Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы. Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов.

Результаты опыта зарисовать через неделю. Сделать выводы об эффективности стерилизующих растворов.

1. Что такое стерильность? Каковы последствия нарушения стерильности?

2. Как стерилизуют помещения биотехнологической лаборатории?

3. Какими способами стерилизуют посуду, инструменты?

Источник

Автоклав – незаменимый помощник при консервировании продуктов

Тот или иной вид консервов – мясных, рыбных или овощных – в своей жизни хоть раз ел практически каждый человек. Ценность таких продуктов обусловлена внушительным сроком годности – консервы могут стоять на полке по нескольку лет и при этом не терять своего вкуса, структуры и других свойств.

Однако тонкостей процесса приготовления знает слишком малое количество потребителей. В частности, лишь немногие знают, что для фабричных консервов, как и для домашних заготовок, требуется стерилизация, а также пастеризация. Разница в том, что при промышленных масштабах производства для этих процессов используется специальное оборудование – паровой промышленный автоклав. Его главной задачей является создание во внутренней камере высокого давления и последующего нагрева помещенной внутрь продукции. Это обеспечивает повышенную устойчивость консервированной пищи к внешним воздействиям, она дольше остается пригодной для использования и одновременно сохраняет вкусовые качества. Для правильного выбора такого аппарата нужно понимать особенности его функционирования, разновидности и другие важные аспекты. И разобраться в этом вам готовы помочь эксперты Foodbay.

Паровой автоклав: принцип работы

В общем виде автоклав – это специальный резервуар, в котором происходит обработка пищевой продукции. Современные модели исполняются в 2 вариантах: замкнутые либо оснащенные крышкой. Размеры и объем рабочей камеры автоклава могут быть различными. Для использования в домашних условиях предлагаются компактные модели объемом до 18 л, чего более чем достаточно для производства консервов для личного потребления. В промышленности же применяются аппараты вместимостью до нескольких сотен квадратных метров. Температура нагрева в закрытой камере автоклава может достигать 500 градусов. При использовании других видов оборудования достичь таких значений практически нереально.

Как именно функционирует промышленный автоклав, используемый для производства консервов? В основе рабочего принципа устройств этого типа лежит возможность разогрева воды при определенных условиях до температур свыше 100ºC. В стандартных условиях это невозможно – при достижении 100ºC она из жидкого состояния начинает переходить в газообразное – проще говоря, она начинает активно испаряться. Самое же главное, что в дальнейшем температура больше 100ºС не поднимается. Поэтому при дальнейших попытках нагреть воду до более высоких значений она попросту испарится.

При использовании же пищевых автоклавов промышленного либо бытового назначения благодаря особым условиям удается разогреть воду до большего значения:

Таким образом, производственный автоклав нужен для полноценной стерилизации консервов, чего невозможно достичь при использовании обычных методов тепловой обработки. Более того, и при домашнем приготовлении консервов такое оборудование существенно упрощает и ускоряет процесс переработки плодово-овощного урожая.

При этом современные модели предоставляют возможность точной настройки рабочих параметров. Оператор перед приведением оборудования в действие может создать в автоклаве требуемые значения температуры стерилизации и давления, какие соответствуют параметрам и особенностям обрабатываемых в агрегате продуктов. Эффективнее всего такое оборудование обрабатывает твёрдую продукцию с непористой структурой, здесь на уничтожение патогенной микрофлоры потребуется минимум времени. В то же время при переработке пористых продуктов, имеющих выраженную пещеристую структуру, процесс может быть несколько затруднителен: необходимо полностью удалить воздух из всех полостей и пор, другими словами, нужно создать абсолютный вакуум в банке – следовательно для стерилизации таких продуктов в автоклаве требуется большее время. Иначе воздух выступит в роли теплоизоляционной защиты для микроорганизмов, и они при стерилизации не погибнут. Соответственно, такие консервы будут представлять для человека определенную опасность.

Особенно важным аспектом качество стерилизации является для мясных консервов. Животные продукты, богатые жирами и белком, при нарушении режима переработки или хранения создают оптимальные условия для развития бактерий. Чтобы не допустить этого, для промышленного производства тушёнки предназначены специальные виды автоклавов – такое оборудование работает по принципу фракционного вакуумирования. Он заключается в последовательном проведении нескольких циклов удаления воздуха, благодаря чему он полностью выводится из обрабатываемого сырья. В результате получается продукт, полностью очищенный от патогенов и поэтому безопасный.

Разновидности автоклавных установок

Важной особенностью этого оборудования является тот момент, что при стерилизации продуктов оно постоянно двигается. В зависимости от характера движения выделяют следующие виды автоклавов:

Для чего требуется двигать стерилизуемую банку? Для лучшей продуктивности: опытным путем установлено, что движущаяся емкость с продуктом прогревается на порядок эффективнее.

При этом на рынок регулярно выходят все новые модели оборудования данного вида, обладающие все более широким набором дополнительных функций и расширенной конструкцией. Так, на пищевых производствах сегодня применяются агрегаты, включающие:

Такие устройства используются не только в пищепроме. Они находят широкое применение в химической, резинотехнической, гидрометаллургической сферах, а также в различных задачах и направления медицины.

Различаются автоклавы и техническими характеристиками используемых теплообменников. По этому основанию выделяют 3 типа оборудования:

В первом случае обменник устанавливается на внешней стороне аппарата. В выносных вариантах он размещается отдельно. Во моделях внутреннего типа теплообменник располагается внутри рабочей камеры.

Особенности применения и технического устройства автоклава во многом зависят также от типа используемой для работы энергии. Выбирать ту или иную модель следует с учетом доступности тех или иных энергоресурсов. В частности, газовый автоклав в промышленности будет рациональным решением в том случае, если ваше предприятие газифицировано. Универсальным же вариантом станет электрическая модель.

На рынке представлены модели механического, пневматического, а также электромагнитного типа.

Различия заключаются и в особенностях расположения рабочей камеры:

Основными показателями, которые требуют контроля со стороны оператора, являются уровень жидкости в камере, создаваемая температура и давление. Выпускаемые сегодня модели оснащаются высокоточными контрольно-измерительными блоками, что существенно упрощает использование оборудования.

Выгоды от применения автоклава

После того, как мы ознакомились с конструкцией и типами промышленных автоклавов, используемых для консервирования, нужно конкретизировать преимущества, которые дает их использование. Прежде всего, благодаря им упрощается и ускоряется процесс стерилизации консервов. Причем использовать их можно как на предприятиях, так и в бытовых условиях. Функционал промышленных и домашних моделей практически одинаков, однако последние отличаются меньшими размерами и производительностью.

К общим преимуществам использования автоклавов можно отнести следующие моменты:

С одной стороны, можно предположить, что высокое давление в камере аппарата создает существенную угрозу. Однако современные модели полностью безопасны благодаря более совершенной конструкции. Здесь используются специальные многоступенчатые комплексы защиты, включающие множество компонентов. В частности, специальная «рубашка» защищает от разрушения конструкцию и соединения резервуара. А если рабочие показатели превысят допустимые значения, система автоматического отключения завершит работу оборудования. Поэтому новые модели автоклавов полностью безопасны и при этом удобны и эффективны.

Приобрести автоклав и другое оборудование для консервирования далее.

Источник

Автоклавирование в лабораториях и медицинских учреждениях

Под автоклавированием понимают обработку инструментов, белья, химической посуды и приспособлений, других материалов горячим паром при повышенном давлении. В этих условиях достаточно быстро, менее, чем за час, погибают все бактерии и вирусы.

Автоклавирование — более узкий термин, чем стерилизация. Стерилизация тоже подразумевает уничтожение всех патогенных микроорганизмов, но способы могут быть выбраны разные, в том числе и автоклавирование. Кроме этого, бывает:
• химическая стерилизация (различными химическими реактивами, например, этиловым спиртом, газами, перекисью водорода, соединениями йода, хлорамином и т.п.);
• стерилизация ультрафиолетом, например с помощью бактерицидных облучателей, установок для обеззараживания воздуха Амбилайф;
• стерилизация ультразвуком;
• обработка инфракрасным излучением;
• стерилизация в сухожаровых шкафах (воздушных стерилизаторах).

Автоклавы

Автоклавирование производится с помощью специальных аппаратов — автоклавов. Автоклавы различаются размерами, конструкцией, назначением. В лабораториях и медицинских учреждениях они применяются для стерилизации. На промышленных предприятиях с помощью автоклавов производят красители, гербициды, резинотехнические изделия, стройматериалы, карбоновые волокна, металлы, продукты питания и многое другое. Выпускаются и бытовые автоклавы для консервирования в домашних условиях.

Принцип работы автоклава основан на том, что при нормальном давлении вода кипит при +100 °С. При дальнейшем подводе тепла, температура воды не повышается, а начинается интенсивное парообразование. Если сосуд закрыт герметично, то давление пара начинает расти. Начинает расти и температура воды и пара. В сбалансированной системе процесс испарения прекращается, а образовавшийся горячий пар легко проникает в клетки микроорганизмов, убивая их.

Горячий пар, в том числе, убивает и споры. Для увеличения обеззараживающего эффекта, многие модели автоклавов оснащены системой для удаления воздуха и кислорода, в нем содержащегося. Дело в том, что кислород может способствовать защите некоторых бактерий. Напротив, пар в автоклаве с откачанным воздухом обладает большей проникающей силой.

Автоклавы бывают разных конструкций, размера, степени автоматизации, но все они состоят из:
• внешнего корпуса, способного выдерживать высокое давление;
• крышки со встроенным манометром и клапаном для снижения избыточного давления;
• камеры с водой, генерирующей пар (оснащена краном для слива остатков воды после окончания работы);
• камеры для стерилизуемых материалов и оборудования, в которую подается пар под давлением.

Подвод тепла может быть как внешним, например, от газовой или электрической плиты, так и встроенным (электронагреватели).

Работа с автоклавом сопряжена с определенным риском. Оставленный без присмотра автоклав способен взорваться. Именно поэтому автоклавированием разрешается заниматься только специально обученному персоналу.

Автоклавирование

Процесс автоклавирования начинается с того, что крышку прибора с помещенными в него стерилизуемыми предметами герметично закрывают и закрывают все краны, кроме клапана для выхода воздуха. В камеру для воды наливают воду и включают нагреватели. Дожидаются того момента, когда камера со стерилизуемым материалом заполнится паром, который начнет вытеснять воздух. Давление поднимают до 1 атмосферы и ждут полного выхода воздуха. После этого доводят давление (по показаниям манометра) до нужной величины и с этого момента начинается отсчет времени стерилизации.

После того, как стерилизация окончена, сначала отключают нагреватели, потом открывают кран и выпускают пар. Только после того, как манометр покажет значение «0», крышку можно открыть. Все материалы из автоклава сразу же выгружают — оставлять их там нельзя! Воду из камеры сливают и оставляют автоклав для просушки.

Различают два основных режима автоклавирования:

1. Более жесткий с температурой +132 °С и давлением в 2 атмосферы. Время стерилизации 20 минут. В этом режиме стерилизуют перевязочный материал, стеклянную, фарфоровую и из нержавейки посуду, устойчивые к коррозии инструменты, стеклянные шприцы, иглы, пинцеты и пр.; белье, спецодежду.
2. Щадящий с температурой +120 °С и давлением 1,1 атмосферы. Время — 45 мин. Так стерилизуют изделия из пластиков (полипропилен, полиэтилен высокой плотности, полистирол), резины, латекса.
В медицинских учреждениях и биологических лабораториях периодически проводят проверку работы автоклава. Для этого при очередном цикле работы устройства внутрь закладывают ампулы с бензойной кислотой (становится фиолетового цвета при нагревании до +120 °С) или с мочевиной (расплавляется при +132 °С). Для более точного анализа в автоклав закладывают пробирки с сапрофитами и их спорами, а потом в лаборатории проверяют, пережили ли они процедуру.

Источник

Тема 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОИЗВОДСТВА ОСНОВНЫХ

БИОТЕХНОЛОГИЯ

(учебное пособие часть III)

по специальности ветеринарно-санитарная экспертиза,

Учебное пособие «Биотехнология» часть III написано профессорами Госмановым Р.Г. и Галиуллиным А.К. и предназначено для студентов, обучающихся по специальности ветеринарно-санитарная экспертиза, квалификация «Бакалавр».

Печатается по решению Ученого совета факультета ветеринарной медицины КГАВМ им. Н.Э.Баумана от 20 ноября 2013 г., протокол № 10.

Рецензенты: проф. И.Н. Никитин

Методические рекомендации по организации самостоятельной работы студентов

Тема 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОИЗВОДСТВА ОСНОВНЫХ

ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Технологические линии, стадии и этапы производства

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, био­физических, физико-химических процессов, и состоит из большого числа разнотипного оборудования, связанного между собой материальными, энергетическими потоками и образующих технологические линии. Характер этих связей может быть весьма разнообразным: продукты и полупродукты, вырабатываемые в одних аппаратах, поступают в следующие по ходу процесса аппараты; сырье и энергия распределяются между различными потребителями.

Производство биопрепаратов осуществляется на технологических линиях производства противобактерийных, противовирусных, ди­агностических препаратов, сывороток, глобулинов, пробиотиков, антибиотиков.

Технологические процессы включают следующие операции:

1. Приготовление противобактериальных инактивированных вакцин:

— приготовление посевного материала;

— приготовление питательных сред;

— выделение и очистка препаратов;

— инактивация микробной массы;

— лиофильное высушивание биопрепарата;

— расфасовка (розлив) вакцины;

— укупорка и закатка флаконов (запайка ампул).-

2. Приготовление противовирусных вакцин:

— приготовление культуры клеток;

— выделение и концентрирование вируса;

Типовая технологическая схема производства биопрепаратов

— стабилизация и стандартизация вакцины;

— лиофильное высушивание биопрепарата;

— расфасовка (розлив) вакцины;

— укупорка и закатка флаконов (запайка ампул).

К вспомогательным технологическим стадиям относятся:

— очистка и стерилизация воздуха;

— подготовка посуды и оборудования;

— очистка и стерилизация жидких продуктов;

— очистка и стерилизация продуктов производства;

— этикетировка и упаковка готовой продукции.

Тема 2. ТРЕБОВАНИЯ К ОБОРУДОАНИЮ ПРОЦЕССОВ

В БИОТЕХНОЛОГИИ И МЕТОДЫ ИХ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

Число используемых процессов микробиологического синтеза до­статочно велико. В зависимости ‘от вида процесса, применяемых сырья и культуры микроорганизмов используется различное оборудование (исходя из предъявляемых требований к аппаратуре). Так, для проведения анаэробных биотехнологических процессов (производство этанола, органических кислот, некоторых вакцин и др.) не требуется подачи воздуха в аппарат, обычно не надо интенсивно перемешивать среду, а в ряде случаев отпадает необходимость соблюдать асептические условия культивирования (культивирование дрожжей).

Для осуществления аэробных процессов производства биологически активных веществ (антибиотиков, аминокислот, ферментов, антигенов, некоторых вакцинных препаратов), напротив, необходимо обеспечить интенсивную аэрацию и перемешивание культуральной жидкости, соблюдать строго асептические условия, решить сложные вопросы пеногашения и т.д. Поэтому возникает необходимость стерилизовать поступающий на биопредприятие и в аппаратуру воздух, зонировать помещения, стерилизовать приборы и аппараты.

Чтобы процесс культивирования микроорганизмов проходил про­дуктивно, необходимо соблюдать следующие правила:

1. Обеспечить подвод кислорода к клеткам и отвод образующегося диоксида углерода из культуральной жидкости (аэробы).

С учётом этих требований, а также особенностей конкретных процессов разработано большое число конструкций аппаратов для культивирования.

Оборудование для микробиологической промышленности изготавливают из высоколегированных марок нержавеющей стали, что в значительной степени оправдано.

Внутренняя поверхность стенок биореактора, применяемого для глубинного культивирования микроорганизмов в стерильных условиях должна быть тщательно отполирована, желательно до зеркального блеска. Наличие грубо обработанных стенок может привести к загрязнению культуры посторонней микрофлорой, особенно в условиях непрерывного культивирования, длящегося до 30 и более суток.

Трубопроводы, подводимые к биореакторам и др. аппаратам, с которыми они технологически связаны, должны располагаться системно и обеспечивать возможность их раздельной стерилизации.

Конструктивное оформление биореактора определяется также выбранным способом отвода тепла. Известно, что в зависимости от природы микроорганизма и стадии его развития изменяется количество выделяемого тепла.

Выбор типа и конструкции биореактора зависит от пенообразующих свойств среды и способа пеногашения. Под влиянием жиров и др. химических пеногасителей значительно изменяется проницаемость цитоплазматической мембраны, ухудшается обмен веществ, что в свою очередь приводит к ингибированию биосинтеза. Естественно, поэтому стремление к полной или, если это невозможно, хотя бы частичной замене химических средств пеногашения механическими, что влечет за собой конструктивные изменения аппарата.

Применение эффективных механических средств пеногашения без добавления химических пеногасителей усложняет конструкцию аппарата, но при этом значительно снижает расход дефицитных жиров и одновременно интенсифицирует биосинтез.

Значение процесса аэрации культуральной жидкости не ограничивается лишь доставкой О₂ к клеткам. В последнее время всё большее внимание исследований уделяется вопросам десорбции газообразных продуктов метаболизма и, прежде всего, диоксида углерода. Установлено, что лимитирующим фактором при культивировании может быть не массообмен по кислороду, а недостаточная интенсивность десорбции газообразных продуктов метаболизма. В частности, предполагается наличие как минимальной, так и максимальной критических концентраций СО₂.

Процесс аэрации неизбежно сопровождается перемешиванием культуральной жидкости. Однако этот процесс неизбежно связан с механическим воздействием на клетки. Последствия этого воздействия могут быть благоприятными, если наблюдается разрушение конгломератов (гранул) клеток, и вредными, если наблюдается разрушение или повреждение клеток.

Следовательно, для каждого контрольного процесса культивирования перемешивание лимитирует процесс по одному из следующих трех направлений:

1. Массопередача газ-жидкость (создание одинаково высокой турбулентности питательной среды по всему объёму аппарата обычно не удаётся, поэтому стремятся к тому, чтобы вся жидкость прошла через зоны, где турбулентность наиболее интенсивна).

2. Массопередача жидкость-клетка (определяется перемешиванием в околоклеточной зоне и зависит от размеров клетки).

3. Механическое воздействие на клетку (зависит от срезывающих усилий, возникающих в жидкости из-за градиента скорости (сдвига). Количественно срезывающие усилия обычно характеризуются окружной скоростью лопасти мешалки).

Культуральные жидкости являются классическим примером жидкости, которая хорошо пенится.

Пенообразование при проведения аэробного процесса культивирования, безусловно, следует отнести к категории вредных явлений, осложняющих ведение процесса, поскольку:

— образование пены ведёт к уменьшению коэффициента заполнения культиватора;

— увеличиваются потери из-за уноса культуральной жидкости;

— затрудняется борьба с загрязнениями и могут выйти из строя фильтры для очистки аэрирующего воздуха;

— пенообразование ухудшает условия снабжения микроорганизмов О₂, питательными веществами и отвода продуктов метаболизма.

Для регулирования уровня пены при культивировании микроорганизмов и предотвращения её выброса из биореактора используют различные методы. Их можно разделить на пять групп.

1. Воздействие на пену химическими и физико-химическими средствами: использование питательных сред с пониженными пенообразующими свойствами; добавление ПАВ, уменьшающих прочность пленок пены.

2. Разрушение пены механическими, гидро- и аэродинамическими способами; ударное воздействие поверхностей деталей и элементов воздействие жидкости или газа; сепарирование пены инерционными, центробежными и другими методами; лёгкое изменение давления газа в пене; захват и разрушение пены потоками перемешиваемой жидкости.

3. Разрушение пены при физических воздействиях: колебания звуковой и ультразвуковой частоты; термическое пеногашение острым паром или при помощи нагретой жидкости; электрическое пеногашение.

4. Стабилизация, уровня пены путём временного уменьшения расхода аэрирующего воздуха, отключения механической мешалки, вывода избыточной пены из-аппарата.

5. Комбинированные воздействия. На практике применяются в основном химические и механические способы пеногашения, а также их сочетания.

Комбинированные системы автоматического пеногашения позволяют наиболее эффективно регулировать уровень пены в ферментаторе при минимальном расходе электроэнергии и химического пеногасителя. Стабильность уровня пены обеспечивает наиболее благоприятные условия для снабжения микроорганизмов О₂ и отвода СО₂. Достижения в области развития клеточных культур, в первую очередь, связаны с созданием широкого круга культурально-тканевых противовирусных вакцин.

Новый мощный стимул культурально-тканевые методы получили в результате разработки гибридомной и ДНК-рекомбинантной технологии, с помощью которых можно получить широкий спектр биопрепаратов и удешевить производства многих традиционных биологически активных веществ.

Необходимо отметить, что аппаратурное оформление технологических стадий производства противовирусных вакцин существенно отличается от аппаратурного решения производства противобактерийных вакцин в силу своей строгой специфичности.

Развитие новых молекулярно-биологических методов и внедрение их в практику будет осуществляться на фоне успехов в разработке технологического оборудования и технических средств контроля и управления.

С помощью селекционированных, стимулированных, модифици­рованных и рекомбинантных клеточных систем осуществляется лабораторное и промышленное производство различных биопрепаратов. Особо необходимо отметить достижения в гибридомной технологии, на базе которой удалось осуществить производство широчайшего спектра лечебных и диагностических моноклональных антител.

Моноклональные антитела, находят применение для лечебных целей и используются для очистки иммуноактивных препаратов.

Используемые среды для систем клеток животных могут быть сложными (60 компонентов и более). В то же время исследователи располагают пока еще недостаточной информацией о том, что и как генерирует растущая клетка, и что и как она секретирует в окружающую среду. Поэтому пока трудно сказать, какая конкретно требуется новая среда, но она должна быть дешевле существующих, проще в изготовлении и применении, содержать меньшее число компонентов, обладающих большей химической определенностью, и отличаться большей универсальностью. Здесь необходимы дальнейшие исследования. Побудительной причиной и ориентиром проведения разработок могут служить требования, предъявляемые к системам, предназначенным для производства моноклональных антител.

Существуют два основных подхода к созданию необходимого оборудования. Первый подход предполагает создание оборудования, предназначенного для ведения в оптимальных условиях только данного специфического процесса. Второй подход заключается в том, чтобы сконструировать многоцелевое оборудование, способное выполнять любой вид работы из заданной программы.

Примером первого подхода может служить создание аппаратуры для производства клеток животных, способных к генерированию целевых продуктов.

Альтернативная методология, предусматривающая иммобилизацию клеток на поверхности элементов надосадочного слоя, заключается в содержании клеток внутри пористых матриц. Такие системы были проверены в аппаратуре для производства антител из гибридомных клеток.

Разрабатывается аппаратура, позволяющая осуществлять гомогенное или квазигомогенное культивирование клеток животных (т.е. на микроносителях) в масштабах от 100 до 1000 л; с его помощью можно выращивать клетки животных (включая гибридомы) в суспензии. Незначительная модификация (ввод воздуха и установка мешалки с приводом) приводит к тому, что данное оборудование становится пригодным для производства бактерий, дрожжей и грибов. В принципе, в таком оборудовании можно производить и культуру клеток растений.

Однако во всех случаях отбор оборудования необходимо производить с учетом показателей, характеризующих его эксплуатационно-производственные качества, сопоставимые с оборудованием альтернативных систем, например: эрлифтные и башенные или колоночные биореакторы, аппараты с тяговыми трубами и др. В этом состоит суть технологической оценки конкурирующих аппаратов. Следует иметь в виду, что для большинства (если не для всех) линий клеток животных пока остаются неизвестными факторы, обуславливающие их высокую чувствительность к «срезающим усилиям», а также механизм, благодаря которому «пузырьки» интерферируют с выживаемостью и продуктивностью этих клеток. Такие вопросы лучше всего решать путем применения для культивирования клеток нестандартных сосудов и обеспечения контролируемых условий проведения процессов на основе создания непрерывно-проточных систем культивирования по схеме хемостата или турбидостата.

Как и в других областях биотехнологии, в области культивирования клеток животных и получения из них целевых продуктов невозможно увеличить размер рабочего оборудования без изменения его основных геометрических свойств и массообменных характеристик (отношение жидкости к ее объему и вводимой мощности к объему жидкости, а также коэффициента массопередачи кислорода К_L). Ощущается недостаток знаний о масштабировании таких систем культивирования клеток животных, для которых образование газовых пузырьков (и мелких пузырьков, генерирующих высокие площади контакта) является явлением нежелательным. Необходимо также иметь больше информации о факторах, ограничивающих рост клеток в циклической и непрерывной культурах.

Для оптимизации работы оборудования и процессов необходим монтаж в рабочей схеме соответствующих датчиков локальных и управляющих компьютеров, а также электронно-вычислительных машин.

За последние годы технический уровень производства биопрепаратов претерпел значительные количественные и качественные изменения. Глубинный метод культивирования становится преобладающим при изготовлении противобактерийных вакцин. Наблюдается тенденция к более широкому внедрению данного метода и в производстве противовирусных препаратов.

Основной целью оснащения биологических процессов современным оборудованием, техническими средствами механизации и автоматизации является повышение производительности и качества биопрепаратов, охрана труда и вопросы экологии.

Широкое привлечение в биотехнологии методов математического моделирования, оптимизации, масштабирования, реализации системного подхода с использованием экономико-математических методов автоматизации и методов кибернетики придало этому направлению своеобразные черты, обусловленные характером технологии, подчиненностью потребностям и специфики живых объектов и своеобразными чертами экономики биотехнологических процессов и их аппаратурного оформления.

МАТЕРИАЛА

В основе хранения культур лежит охлаждение, замораживание или обезвоживание. Во всех этих случаях должен быть резко сокращен или полностью прекращен клеточный обмен веществ.

На практике культуры штаммов хранят с использованием следующих основных способов:

— замораживание со стабилизатором и хранение при температуре ниже

-20°С. Недопустимо многократное оттаивание и замораживание;

— лиофилизация культуры и хранение в ампулах в течение нескольких лет.

Через определенное время, оптимальное для каждого способа хранения, культуру пересевают.

Перед началом технологических процессов культуру размножают в стерильных условиях.

Для приготовления посевного материала используют полноценную среду. Количество питательной среды в инокуляторе и биореакторе не должно превышать 70% от общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема питательной среды.

Для промышленных биореакторов обычно используют от 6 до 10% инокулянта. С плотной питательной среды выросшую культуру смывают стерильной питательной средой или физраствором и вносят в инокулятор в таком же объеме как и жидкую.

Тема 6. АППАРАТУРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ

Получение высококачественных биопрепаратов в значительной степени зависит от аппаратурного оформления процессов приготовления и стерилизации питательных сред.

Для стерилизации питательных сред используют следующие методы:

— физические (термическая стерилизация, фильтрация);

— химические (щелочи, кислоты, соли металлов).

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Наиболее широкое применение для стерилизации питательных сред в настоящее время нашел метод термической стерилизации. Как уже отмечалось в предыдущем разделе, инактивация микроорганизмов под действием перегретого пара подчиняется уравнению кинетики первого порядка. Нагрев стерилизуемой среды осуществляется до тех пор, пока температура питательной среды станет равной температуре пара. Именно в этот момент начинается процесс стерилизации, приводящий в результате к гибели всех контаминирующих микроорганизмов.

Для стерилизации питательных сред пар используется в двух режимах: в «статических» условиях автоклава и для стерилизации с перемешиванием (с пуском пара в стерилизующую зону). Автоклавы применяются для стерилизации лабораторных биореакторов, посуды, питательных сред в относительно небольших объемах и при культивировании в монослое.

Во многих автоклавах пар производится из воды, нагреваемой электрическими тэнами. Если пар поступает от внешнего источника то необходимо, чтобы он был насыщенным. Перегретый пар по своему режиму более напоминает газ, стерилизация в этом случае напоминает стерилизацию сухим теплом.

По своим конструктивным особенностям все автоклавы могут быть поделены на четыре основные группы:

— стерилизаторы оросительного типа на горячей воде;

Стерилизаторы оросительного типа на горячей воде работают по принципу прямого орошения горячей водой и ее прямого охлаждения с использованием регулируемого опорного давления. Газовые автоклавы (ЕТО-стерилизаторы) используются в тех случаях, если материал стерилизуемого продукта не выдерживает термической стерилизации.

ЕТО-газ (90% этиленооксида и 10 % СО₂ N₂), проникая в продукт, стерилизует его, не вызывая никаких структурных изменений материала.

Перспективным, с точки зрения экономики производственных плошадей и энергозатрат, является использование комбинированных стерилизаторов (автоклавов), использующих пар (формальдегид). Стерилизаторы данной конструкции используются для стерилизации паром и формальдегидом термолабильных материалов. Они обычно снабжены набором стерилизационных программ.

В настоящее время стерилизация питательных сред в основном осуществляется в реакторе-смесителе или непосредственно в биореакторе. Целью стерилизации является инактивация бактериальных спор.

Однако многие компоненты питательных сред (витамины, гормоны и т.д.) являются крайне чувствительными к длительному температурному воздействию.

Значительное повышение температуры стерилизации при сокращении времени от 24,8 мин до 0,366 сек приводит к сохранению 89 % витаминов в среде.

ДИАГНОСТИКУМОВ

Исследования сывороток больных животных на наличие в них антител, а также определение титров антител в специфических сыворотках при их промышленном изготовлении осуществляется с помощью антигенов-диагностикумов.

При изготовлении бактериальных антигенов используют или живые культуры или взвеси убитых микроорганизмов.

Приготовление диагностикумов связано, прежде всего, с тщательной подготовкой и селекцией штаммов микроорганизмов, из которых они готовятся. Производственные штаммы должны находиться в S-форме. Это обеспечивает им хорошую агглютинабельность, специфичность и образование устойчивой гомогенной взвеси.

Чаще всего для получения диагностикумов определённые штаммы микроорганизмов выращивают на агаровых средах. Культуры бактерий смывают с поверхности агара, а затем их инактивируют 0,5%-м раствором формалина (бруцелёзный, туляремийный антиген), 1%-ми растворами борной кислоты (листериозный, сальмонеллёзный, коли-антигены), нагреванием (бруцеллёзный антиген) и другими методами.

Антигены бывают корпускулярными и растворимыми.

Во всех случаях антигены подвергают высокой степени очистки. Такие антигены используются для постановки РА, РСК, РДСК.

Примером получения корпускулярного антигена является изготовление

листериозного антигена для РСК из производственных штаммов листерий двух серогрупп (по 2 штамма на серогруппу).

Растворимые антигены чаще всего готовят в виде экстрактов из агаровых культур микроорганизмов. Они используются для РСК при сапе, бруцеллёзе, инфекционном эпидидимите баранов и других заболеваниях, а также при постановке диагноза с применением реакции иммунодиффузии (РИД) на бруцеллёз и другие инфекции.

О-диагностикумы готовят обычно из неподвижных вариантов культур, полученных при выращивании на плотных питательных средах и обработанных спиртом или глицерином.

Чтобы повысить эффективность диагностики в системе организации противоэпизоотических мероприятий, необходимо расширить ассортимент высокоэффективных диагностикумов, пригодных к использованию в лабораторных условиях. Для этого готовят корпускулярныe антигены, окрашенные какими-либо красителями. Например, для постановки пластинчатой реакции агглютинации на бруцеллёз в настоящее время широко применяют антиген, представляющий взвесь в буферном растворе микробных клеток Br.abortus 19, инактивированных нагреванием и фенолом и окрашенных бенгальской розовой в малиново-розовый (розбенгал-проба).

При постановке диагноза на бруцеллез для кольцевой реакции с молоком используется антиген в виде взвеси инактивированных нагреванием бруцелл, окрашенных гематоксилином в синий цвет.

При диагностике пуллороза-тифа птиц при постановке кровекапельной реакции агглютинации (ККРА) на стекле используют цветной антиген, представляющий собой гомогенную взвесь микробных клеток S.gallinarum, убитых формалином и окрашенных генцианвиолетом.

Эритроцитарные диагностикумы. При некоторых инфекционных заболеваниях (бруцеллез; пуллороз, колибактериоз, пастереллез и др.) рекомендуются и производятся промышленным способом эритроцитарные диагностикумы.

Для получения полисахаридно-полипептидной фракции проводят гидролиз бактерийной массы бактерий уксусной кислотой и осаждают ее этиловым спиртом.

Кровь для получения эритроцитов берут стерильно из яремной вены барана в сосуд со стерильным раствором Олсевере. Эритроциты несколько раз отмывают стерильным фосфатным буфером, центрифугируют, консервируют формалином и ресуспендируют в фосфатно-буферном растворе. Затем их сенсибилизируют полисахаридно-полипептидной фракцией сальмонелл. Сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатным буфером с формальдегидом до 10 %-ной концентрации, расфасовывают во флаконы и сдают на контроль.

Эрйтроцитарный антиген контролируют на активность, специфичность, стерильность, концентрацию эритроцитов и рН.

ВАКЦИН

Инактивированные вакцины обычно содержат значительное количество посторонних вирусных белков, если в качестве активного компонента вакцины использовался цельный вирус. Концепцию биохимически чистой вакцины можно реализовать, если идентифицировать те компоненты вируса, которые стимулируют в организме реципиента образование нейтрализующих антител. Поэтому были разработаны методы получения очищенных препаратов биологически активных вирусных субъединиц, с целью усовершенствования инактивированных; противовирусных вакцин.

Существуют следующие методы фракционирования вирусных антигенов:

2. Сепарация. Обработка вирусной суспензии соответствующим солюбилизирующим агентом приводит к разрушению вирусных частиц и выходу из них необходимых субъединиц. В результате получается смесь вирусных нуклеотидов и поверхностных субъединиц. Получить чистые субъединичные препараты можно только при разделении смеси. Одним из простейших методов отделения является адсорбирование смеси гидроокисью алюминия. Гель гидроокиси добавляется к смеси при надлежащем значении рН, полученная система подвергается центрифугированию. Надосадочную жидкость отделяют, а конгломераты гидроокиси с адсорбированными субъединицами ресуспендируют в нужном разбавителе.

В препаративном масштабе нашел применение метод использования хроматографических колонок. Но гораздо шире применяется метод выделения субъединиц с помощью центрифугирования в градиенте плотности (обычно в градиенте сахарозы). Этот метод применим как в препаративных, так и в крупномасштабных операциях.

Субъединицы, как правило, имеют меньшую плотность, чем вирусные нуклеотиды. Поэтому, когда солюбилизированная смесь центрифугируется через градиент плотности сахарозы, субъединицы и нуклеотиды будут образовывать четкие и хорошо разделяющиеся слои, которые можно собрать как самостоятельные фракции.

После выявления и выделения индивидуальных протективных антигенов возбудителя приступают к конструированию субъединичной вакцины по определенной рецептуре.

Вакцины из расщепленного вириона (сплит-вирусные вакцины) получают путем обработки эфиром цельной вирусной частицы. Такая вакцина содержит в себе осколки разрушенных вирусных частиц со всеми антигенами вируса, включая балластные примеси. Липиды при обработке вирионов этиловым эфиром в основном удаляются, что ведет к снижению пирогенных реакций и лучшей переносимости таких прививок.

Субъединичные вакцины обладают высокой иммуногенностью только при условии правильного их приготовления. Высоко очищенная субъединичная вакцина почти полностью свободна от посторонних белков клеточной или вирусной природы.

Субъединичные вакцины стандартизируют по массе белка на дозу и по специфичности иммунизирующего гликопротеида.

ДИАГНОСТИКУМОВ

Приготовление вирусных диагностикумов имеет свои особенности. Диагностические антигены готовят, используя органы зараженных животных, то есть в таком случае речь идет об органных антигенах. Если такие антигены готовят с использованием культур клеток, то получают культуральные антигены. Основным их недостатком является содержание в своем составе балластных белков, в том числе белков других вирусов, которые могут быть в исходном сырье. Это влияет на специфичность и активность антигенов. Поэтому одной из сложных задач при производстве вирусных препаратов является их очистка.

Технология производства вирусных антигенов (герпеса простого и вируса болезни Ауески):

1. В роллерный матрац Винчестера с минимальной средой Игла(МСИ),содержащей 10 % триптозофосфатного бульона и 10 % сыворотки теленка, внести 2 10 7 клеток ВНКС13 и выращивать при 37 0 С в течение 3 сут.

2. Инфицировать культуру клеток суспензией производственного штамма вируса (20 мл в среде Игла, не содержащей сыворотки) при множественности заражения 1 БОЕ на 300 клеток.

4. Встряхивая сосуды, отделить клетки от стекла. Если клетки не отделяются, обработать монослойной раствором версена.

6. Слить надосадочную фракцию и центрифугировать ее при 20000 g в течение 90 мин.

7. Полученную надосадочную фракцию слить в раствор хлорофоса, а осадок суспендировать в МСИ с 10% триптозофосфата и 5% сыворотки теленка (2 мл на бутыль).

8. Образовавшие осадок клетки разрушить в УЗД или тремя циклами замораживания и оттаивания в водяной бане.

9. Осадить обломки клеток при 400 g в течение 10 мин.

10. Надосадочную жидкость, содержащую вирус, проверить на бактериальное загрязнение, инокулируя препараты в бульон с экстрактом сердца и мозга (1 неделя при 37 0 С) или в жидкую среду Саборада (1 неделя при 37 0 С).

11. Вирусы очищают седиментацией в растворах с высокой плотностью, например в насыщенных растворах КВг. В этих условиях выявляются полосы, соответствующие вирионам и пустым частицам.

12. Проводят контроль качества препарата согласно нормативной документации.

ХОЗЯЙСТВА

Источник